LncRNA CCAT1通过MAPK/ERK通路影响子宫内膜癌细胞的侵袭转移①

李 林 魏旭静 路素双 刘 晶 （河北医科大学第一医院妇产科，石家庄 050000）

子宫内膜癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，严重威胁女性患者的生命和健康。子宫内膜癌的病因和发病机制复杂，普遍认为子宫内膜癌的发生发展是多步骤多基因控制的复杂过程。子宫内膜癌的侵袭迁移能力严重影响患者预后，探讨子宫内膜癌细胞侵袭迁移的机制对改善患者预后具有 重 要 意 义［1-2］。 长 链 非 编 码 RNA（LncRNA）CCAT1 在多种恶性肿瘤中高表达，被认为是一种癌基因，CCAT1 在多种恶性肿瘤的侵袭迁移中也发挥重要作用［3-4］，但CCAT1参与恶性肿瘤细胞侵袭迁移的机制复杂。MAPK/ERK 信号通路参与恶性肿瘤的侵袭迁移过程，MAPK/ERK 信号通路激活可促进恶性肿瘤细胞的侵袭迁移［5-6］。CCAT1 是否可通过MAPK/ERK 信号通路参与子宫内膜癌细胞的侵袭迁移尚不明确。本文对子宫内膜癌KLE 细胞中CCAT1 的表达以及沉默CCAT1 对子宫内膜癌侵袭迁移和MAPK/ERK信号通路的影响进行研究，探讨CCAT1在子宫内膜癌侵袭迁移中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人子宫内膜癌细胞系KLE 和正常人子宫内膜基质细胞系T-HESC（中国科学院上海细胞库）；CCAT1 siRNA（CCAT1-siRNA）和 NC siRNA（NC）（广州博锐生物科技）；Lipofectamine 2000 试剂盒（美国Invitrogen 公司）；聚合酶链反应（PCR）试剂盒、逆转录（RT）试剂盒、Trizol 试剂、ECL 化学发光试剂盒（美国Sigma 公司）；胰蛋白酶、DMEM 培养基、ERK 通路激动剂表皮生长因子（EGF）（美国BPB公司）；兔抗人ERK 单克隆抗体、兔抗人p-ERK 单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）；Transwell 小室（美国Corning公司）；PCR扩增仪（美国Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光 RT-PCR 测定 KLE 和 T-HESC 细胞中CCAT1 水平 miR Vana miRNA 法分离两种细胞总RNA ，每组设7 个复孔，分光光度计测定RNA 浓度和纯度。将分离的RNA 逆转录为cDNA，采用PCR 测定两细胞中CCAT1 水平（CCAT1 上游引物为5'-CCA TTC CAT TCA TTT CTC TTT CCT A-3'，下游引物为 5'-GGC GTA GGC GAT TGG GGA TCG-3'）。PCR 反应条件为 95℃ 30 s；95℃ 15 s；58℃ 30 s，共40 个 循 环 。 以 U6 为 内 参 照 。 CCAT1 水 平 以 2−ΔΔCt表示。

1.2.2 细胞分组和转染 取对数生长期的KLE 细胞分为空白对照组（BC 组）、阴性对照组（NC 组）、CCAT1-siRNA 组和 CCAT1-siRNA+EGF 组，根据 Li‑pofectamine 2000 试剂盒说明转染各组细胞：取各组对数生长期的KLE细胞接种到6孔板中（5×105个/孔）培养24 h，细胞生长至90%以上融合时进行转染，CCAT1-siRNA 组 转 染 CCAT1-siRNA，CCAT1-siR‑NA+EGF 组转染CCAT1-siRNA 并加入30 ng/ml EGF 处理［7］，NC 组转染阴性对照 siRNA，BC 组不转染。转染48 h，采用实时荧光RT-PCR 测定，细胞中CCAT1水平，方法同1.2.1。

1.2.3 Transwell 测定各组KLE 细胞侵袭能力 取转染48 h 各组KLE 细胞，培养至对数生长期时用无血清培养基重悬细胞，接种到Transwell 小室上室（1×104个/孔），小室下室加入含胎牛血清的培养基，培养24 h，抽吸基质胶去除上室孔内细胞，并用棉签擦拭，小室下室细胞用乙醇固定10 min，结晶紫染色15 min，显微镜下观察并计算穿膜细胞数。每组设7个复孔。

1.2.4 划痕实验测定各组KLE 细胞迁移能力 将各组转染48 h KLE 细胞培养至对数生长，在6 孔板背面用0.5 mm 记号笔每隔1 cm 划平行直线标记，将对数生长期KLE 细胞密度调整为1×106个/ml，接种到标记好的6 孔板中，贴壁生长后，取长势良好、密度均匀的细胞做划痕：用20µl枪头在细胞面垂直版面划直线，出去划痕部位残留细胞，培养24 h 后，显微镜下测量0 h 和24 h 划痕距离，计算细胞迁移距离（迁移距离=0 h划痕距离−24 h划痕距离）。

1.2.5 Western blot 测 定 各 组 KLE 细 胞 ERK 和 p-ERK 蛋白水平 取各组转染48 h KLE 细胞，提取各组细胞总蛋白质，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，经过转膜后，加入BSA 封闭2 h，加入一抗（兔抗人ERK 单克隆抗体、兔抗人p-ERK 单克隆抗体）（1∶500）过夜孵育，加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，以β-actin 为内参照。用Image J 图像分析软件分析条带灰度值。目标蛋白水平以目标蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值表示。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0 软件分析，CCAT1 水平、侵袭细胞数、迁移距离以及E-cadh‑rein、Vimentin、Snail、Twist、ERK 和 p-ERK 蛋白水平以表示，两组采用t检验，三组采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验，取P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCAT1 在 KLE 细胞中的表达 KLE 细胞中CCAT1 水平（1.83±0.17）高于 T-HESC 细胞（1.00±0.09）（t=11.416，P<0.001）。见图1。

图1 KLE和T-HESC细胞中CCAT1水平Fig.1 CCAT1 levels in KLE and T-HESC cells

2.2 CCAT1-siRNA 对 KLE 细胞中 CCAT1 水平的影响 与 BC 组（1.00±0.11）和 NC 组（0.98±0.09）比较，CCAT1-siRNA 组KLE细胞中CCAT1水平（0.37±0.08）降低（F=101.237，P<0.001），BC 组和 NC 组KLE 细胞中CCAT1水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

图2 各组KLE细胞中CCAT1水平Fig.2 CCAT1 levels in KLE cells of each group

2.3 各组KLE 细胞侵袭能力比较 与BC 组和NC组比较，CCAT1-siRNA 组KLE 细胞侵袭细胞数降低（P<0.05），与CCAT1-siRNA 组比较，CCAT1-siRNA+EGF 组KLE 细胞侵袭细胞数升高（P<0.05），BC 组和NC 组KLE 细胞侵袭细胞数差异无统计学意义（P>0.05）。见表1和图3。

表1 各组KLE细胞侵袭细胞数和迁移距离比较（）Tab.1 Comparison of number of invasion cells and mi⁃gration distance of each group of KLE cells（）

表1 各组KLE细胞侵袭细胞数和迁移距离比较（）Tab.1 Comparison of number of invasion cells and mi⁃gration distance of each group of KLE cells（）

Note：Compared with BC group，1）P<0.05；compared with NC group，2）P<0.05；compared with CCAT1-siRNA group，3）P<0.05.

Migration distance（mm）7.23±1.21 7.16±1.18 2.69±0.831）2）4.76±0.911）2）3）30.273<0.001 Groups BC NC CCAT1-siRNA CCAT1-siRNA+EGF F P Number of invasion cells 87.42±12.35 85.86±11.58 31.27±8.351）2）52.68±9.141）2）3）47.218<0.001

图3 Transwell测定各组KLE细胞侵袭能力Fig.3 Transwell assay to determine invasive ability of each group of KLE cells

2.4 各组KLE 细胞迁移能力比较 与BC 组和NC组比较，CCAT1-siRNA 组KLE 细胞迁移距离降低（P<0.05），与CCAT1-siRNA 组比较，CCAT1-siRNA+EGF 组KLE 细胞迁移距离增加（P<0.05），BC 组和NC 组KLE 细胞迁移距离差异无统计学意义（P>0.05）。见表1和图4。

图4 划痕实验测定各组KLE细胞迁移能力Fig.4 Scratch test to determine migration ability of each group of KLE cells

2.5 各组KLE 细胞ERK 和p-ERK 蛋白水平比较 各组KLE 细胞ERK 蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）；与 BC 组和 NC 组比较，CCAT1-siRNA 组KLE细胞p-ERK蛋白水平降低（P<0.05），与CCAT1-siRNA 组 比 较 ，CCAT1-siRNA+EGF 组 KLE 细 胞 p-ERK蛋白水平升高（P<0.05），BC组和NC组KLE细胞p-ERK蛋白水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2和图5。

表2 各组KLE细胞ERK和p-ERK蛋白水平比较（）Tab.2 Comparison of ERK and p-ERK protein levels in KLE cells of each group（）

表2 各组KLE细胞ERK和p-ERK蛋白水平比较（）Tab.2 Comparison of ERK and p-ERK protein levels in KLE cells of each group（）

Note：Compared with BC group，1）P<0.05；compared with NC group，2）P<0.05；compared with CCAT1-siRNA group，3）P<0.05.

p-ERK 0.28±0.06 0.27±0.07 0.07±0.021）2）0.18±0.031）2）3）27.238<0.001 Groups BC NC CCAT1-siRNA CCAT1-siRNA+EGF F P ERK 0.51±0.08 0.49±0.11 0.50±0.09 0.52±0.10 0.128 0.943

图5 Western blot 测定各组 KLE 细胞 ERK 和 p-ERK 蛋白水平Fig.5 Western blot analysis to determine ERK and p-ERK protein levels in KLE cells

3 讨论

CCAT1 位于转录因子c-Myc 附近、长度为2 628 nt 的长链非编码RNA，最初在结肠癌中高表达被发现，后来研究发现在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤中高表达，被认为是一种致癌基因，可通过与miRNA 相互作用参与靶基因的调控，从而参与恶性肿瘤的增殖、凋亡、侵袭及迁移等过程，有望成为恶性肿瘤治疗的潜在靶点［8］。大量研究发现CCAT1 参与多种恶性肿瘤的侵袭迁移过程，如CCAT1 可促进前列腺癌、宫颈癌、乳头状甲状腺癌的侵袭和迁移，可通过抑制miR-33a 预防黑素瘤细胞的侵袭，沉默CCAT1 可通过下调Bmi-1 的表达抑制胃癌的侵袭和迁移［9-13］。CCAT1 在子宫内膜癌中的作用也受到大家关注，如YU 等［14］也发现CCAT1 在子宫内膜癌组织和子宫内膜癌KLE、Ishi‑waka、HEC-1-A等细胞中高表达；潘洪丽等［15］研究发现 HEC-1-B 和 AN3CA 细胞中 CCAT1 水平升高，沉默CCAT1 可抑制HEC-1-B 细胞的侵袭迁移和上皮间质转化。但CCAT1 影响子宫内膜癌细胞侵袭迁移的机制尚不清楚。

恶性肿瘤细胞的侵袭迁移受多种信号通路的调控，MAPK 信号通路参与细胞增殖、分化、侵袭、迁移的调控过程，在恶性肿瘤细胞的生长发育及浸润中发挥重要作用。MAPK 有4 条信号通路，其中ERK 途径信号通路在信号传递中发挥重要作用，和人类恶性肿瘤的关系最密切［16］。p-ERK 为 ERK 的活化形式，只有活化的ERK 才具有活性。磷酸化的ERK 可影响多种癌基因的转录和表达，促进血管生成，破坏细胞外基质，促进癌细胞运动而发生转移，MAPK/ERK 信号通路的激活可促进EMT 过程的进展［17］。MAPK/ERK 信号通路在子宫内膜癌侵袭迁移的调控中发挥重要作用［18］。CCAT1 可通过促进恶性肿瘤细胞MAPK信号通路参与恶性肿瘤细胞的侵袭迁移过程，如CCAT1 可通过MAPK 信号通路促进成神经管细胞瘤的转移［19］；通过激活MAPK 信号通路影响胃癌细胞的侵袭迁移［20］。

介于MAPK/ERK 信号通路在子宫内膜癌侵袭迁移的调控中发挥重要作用，CCAT1 可通过MAPK信号通路参与恶性肿瘤的侵袭转移过程，因此推测CCAT1 可能通过MAPK/ERK 信号通路参与子宫内膜癌的发生发展。本文对子宫内膜癌细胞KLE 中CCAT1 的表达子宫内膜癌细胞侵袭、迁移和MAPK/ERK 信号通路的影响进行研究，发现CCAT1在子宫内膜癌细胞中高表达，沉默CCAT1 的表达可抑制子宫内膜癌细胞的侵袭迁移和MAPK/ERK信号通路，给予ERK 通路激动剂处理后沉默CCAT1 的表达对子宫内膜癌细胞的侵袭迁移和MAPK/ERK 信号通路的抑制作用减弱，由此分析沉默CCAT1 可能通过抑制MAPK/ERK 信号通路抑制EMT 过程，从而抑制子宫内膜癌的侵袭迁移。

综上所述，子宫内膜癌KLE 细胞中高表达CCAT1，CCAT1 可能通过抑制 MAPK/ERK 信号通路抑制EMT过程参与子宫内膜癌的侵袭迁移。