大黄牡丹汤对炎症相关性结直肠癌的治疗作用及对TLR4/MyD88/NF-κB-p65信号通路的影响

张传凤 刘 博 葛雨竹 马克龙 汪长中 颜贵明 （安徽中医药大学，合肥230012）

近年来，除受吸烟、缺乏运动、肥胖等因素影响，人们饮食结构、生活习惯改变以及人口老龄化加速，导致我国结直肠癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势［1］。与多种肿瘤发生、发展伴有慢性炎症发展过程相似，结直肠癌中，结肠炎症与炎症相关性结直肠癌（colitis-associated colorectal cancer，CAC）发生发展密切相关［2］。但与经典结直肠癌演进过程不同，溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）发展为结直肠癌是“炎症-不典型增生-癌症”而非“腺瘤-腺癌”的持续性渐变过程［3］。CAC 是UC 的严重并发症之一，虽然仅占所有结直肠癌发病率的1%~4%，但死亡率却占UC 患者的10%~15%。慢性肠道炎症病程迁延、易复发，抗生素、激素和免疫调节治疗等仅能够缓解症状，且长期使用有害无益，因此，寻找可抑制慢性肠道炎症反应、阻断肿瘤发生的药物对炎症性肠病治疗具有重要意义。

肠道慢性炎症机制复杂，涉及众多分子表达异常和信号通路异常激活。目前研究表明，Toll 样受体（TLRs）介导的NF-κB 活化在结肠癌中扮演重要角色［4］。绝大部分恶性肿瘤细胞表达不同的TLRs，而TLR4 是TLR 家族中肿瘤表达谱最为广泛的TLRs，主要识别内毒素，即脂多糖（LPS）。MyD88是含有TLR 结构域的接头蛋白，是TLR 信号通路中的下游信号因子，在TLR 信号通路中起关键作用［5］。在TLR4 主要信号传导通路“依赖MyD88 途径”中，NF-κB活化是中枢环节，启动相关基因转录，促进细胞因子（TNF-α、IL-1β 等）释放，而释放的细胞因子又可反过来进一步活化NF-κB，形成正反馈调节，导致炎症加深，进而发展为癌症［6］。

中药具有多靶点、复发率低、副作用小等特点，在慢性肠道炎症治疗中具有重要作用。既往研究表明，芍药汤、痛泻要方等在炎症性肠病治疗、CAC防治等方面具有重要作用。如采用芍药汤合痛泻要方治疗慢性UC，可有效抑制炎症因子，保护肠道黏膜，减轻炎症反应［7］。与西药相比，中药疗效更好，安全性更高。大黄牡丹汤（Dahuang Mudan De‑coction，DHMD）由大黄、牡丹皮、桃仁、冬瓜子、芒硝5 味中药组成，具有泻热通肠、活血化瘀、散结消肿等作用［8］。目前 DHMD 治疗 UC 的相关研究显示，DHMD 可改善葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的 UC 小鼠炎症状态。本研究深入探讨DHMD在“炎症-不典型增生-癌症”过程中的作用及具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠，6~8 周龄，体重（22±3）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）2014-0007。小鼠自由饮食，实验室常规适应性饲养1 周（饲养温度18~26℃，湿度50%~60%，12 h明/12 h暗）。

1.1.2 主要试剂 美沙拉嗪缓释颗粒（上海爱的发制药有限公司）；DSS（M. W. 36000-50000，批号：S0948，美国MP 公司）；氧化偶氮甲烷（AOM，Sigma公司）；HE 染色液（批号：0912A19，北京Leagene 生物科技有限公司）；大便隐血检测试剂盒（批号：皖20152400174，安徽深蓝医疗科技股份有限公司）；IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA 试剂盒（批号：05/2019，上海酶联生物科技有限公司）；免疫组化通用型试剂盒（小鼠/兔聚合物法检测系统，批号：1919D0919，中杉金桥生物技术有限公司）；DAB 显色试剂盒（×20，批号：K193328E，中杉金桥生物技术有限公司）；TLR4、MyD88、NF-κB-p65 一抗、二抗（Affinity公司）。

1.1.3 主要仪器 TS-12A 生物组织自动脱水机（湖北孝感市宏业医用仪器有限公司）；YD-6L 生物组织冷冻包埋机、YD-AB 生物组织摊烤片机、YD-315 轮转式切片机（金华市益迪医疗设备有限公司）；OLYMPUSBX51 正置显微镜（上海富莱光学公司）；H1-16KR 型冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；Thermo Labserv K3 型酶标仪（上海沃元科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CAC 模型构建 小鼠随机分为6 组，每组20 只。正常对照组小鼠全程自由饮食，其余5 组腹腔注射单次给予小剂量（12 mg/kg）化学诱变剂AOM（1 mg/ml），2 d 后口服给予 3% 致炎剂 DSS 1 周，给予普通无菌水恢复2 周，继续DSS 致炎重复循环2 次，共3 个周期，各周期分为1 周致炎期和2周恢复期，整个实验期间小鼠自由进食［9］。

新课标指出：体育与健康学习评价是提升课堂教学效率，促进学生达到学习目标的主要手段之一。初中体育教学评价应该以多元化评价为主，即需要从多个领域去找到学生身上的闪光点，从而帮助学生能够在原来的基础上获得发展与进步。逐步减少学生之间的横向评价，使学生能够在个体进步中逐渐形成良好的学习习惯，不断突破自己。课堂评价内容要涵盖学生的体能、体育知识、体育技能、参与热情、学习态度以及团队协作等等方面，同时要求学生善于对自身进行评价，明确自身优势与不足，并通积极因素去克服，从而获得更好的发展。

1.2.2 给药治疗分组 正常对照组不做任何处理，自由饮食，其余5 组在第2 周期致炎结束恢复期第1 天再次随机分成5 组：模型组、美沙拉嗪组（600 mg/kg）、DHMD 高剂量组（20 g/kg）、DHMD 中剂量组（10 g/kg）、DHMD低剂量组（5 g/kg）。

1.2.3 DHMD 配制 DHMD 原方（大黄 12 g、牡丹皮 9 g、桃仁 12 g、冬瓜子 30 g、芒硝9 g）除芒硝外加600 ml 水过滤药液，剩余药渣加300 ml 水高温煮沸后转低温煮30 min，过滤药液，将2 次过滤所得药液混合，加入芒硝，真空旋转蒸发仪浓缩药液至生药含量为1 g/ml，4℃ 保存备用（3 d配1次）［10］。

1.2.4 给药剂量 依据《实验动物和动物实验技术》中动物的给药量计算得出，小鼠给药体积按0.2 m/l 10 g 算，对应 DHMD 0.5 g/ml，以此剂量作为给药中剂量，高剂量为1.0 g/ml，低剂量为0.25 g/ml；同理，将美沙拉嗪缓释颗粒碾磨成粉，配制为0.03 g/ml混悬液，现配现用。

1.2.5 小鼠体征变化和疾病活动度评估 小鼠在致炎期每天固定时间称重1 次，各周期恢复期每隔1 d 固定时间称重1 次并记录。每天观察各组小鼠饮食、精神状况、毛发、活动度、大便性状变化，联苯胺法（联苯胺1 g，加冰醋酸至100 ml，置于棕色瓶中，加3%过氧化氢溶液，若粪便变蓝则为阳性）检测大便隐血情况并记录。计算每只小鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI）=（体重下降分数+大便性状分数+便血分数）/3［9］。

1.2.6 结肠病变和脾脏指数测定 提前将小鼠禁食12 h，正常饮水，3%戊巴比妥钠麻醉，摘取眼球取血，纵行剖开腹腔及胸腔，迅速取出小鼠结肠（从肛缘至回盲部），迅速测量长度、拍照并记录一定范围内肿瘤数，生理盐水中清洗干净、去除脂肪组织，分为2份，一份用10%福尔马林固定液固定，另一份置于−80℃保存；取小鼠脾脏去除脂肪组织，生理盐水清洗干净，称重，计算脏器指数=脏器重量（mg）/小鼠体重（g）。

1.2.7 血清细胞因子检测 小鼠眼球取血，静置2 h，4℃、3 000/r min 离心 15 min，取上清，−20℃ 留存备用，用于IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA检测。

1.2.8 结肠组织病理学观察 取出福尔马林固定的结肠组织，常规脱水，包埋，4℃保存备用，切片，HE染色，显微镜下观察结肠组织形态学变化。

1.2.9.1 Western blot 蛋白提取：取出−80℃冻存的结肠组织，每组称量100 mg 组织剪碎，根据试剂盒说明书进行蛋白提取，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，−20℃留存备用。制备分离胶和积层胶，进行SDS凝胶电泳（80 V 30 min→120 V，90 min），湿法转膜（120 V，9 min），封闭（5%牛奶，2 h），加入一抗（β-actin 1∶5 000 稀释，TLR4、MyD88 和 NF-κB-p65 1∶1 000 稀释）4℃孵育过夜，加入二抗孵育2 h（1∶10 000），曝光显影，分析β-actin、TLR4、MyD88和NF-κB-p65蛋白表达。

1.2.9.2 IHC 包埋好的组织切片后在梯度乙醇中脱蜡和水化，柠檬酸钠缓冲液中进行抗原热修复，静置冷却至室温，加入过氧化物酶室温孵育10 min，PBS 冲洗 3 次，3 min/次，滤纸擦干，加入一抗4℃孵育过夜，PBS 冲洗，滤纸擦干，滴加二抗室温孵育 20 min，PBS 冲洗，室温 DAB 显色，流水冲洗终止染色，梯度乙醇和二甲苯中脱水、透明，自然风干，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

1.3 统计学处理 采用SPSS23.0 及GraphPad Prism6.0 软件进行统计学分析，计量资料以表示。组间比较采用单因素方差分析中的Q检验（LSD 法），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体征变化和疾病活动度评估 造模 第1 周期结束，除正常组外，部分小鼠体重明显减轻、毛色由黑亮有光泽逐渐变为暗淡无光、活动减少、反应迟缓、大便变软；第2 周期致炎结束，除对照组外，多数小鼠精神萎靡、食欲不振、便血、大便稀、出现死亡；给药2周后，小鼠体重部分恢复，食欲改善，便血减少。各组小鼠体重均有变化，但无统计学意义（图1A）。正常组小鼠疾病活动指数大都接近于0，与正常组相比，模型组小鼠出现体重明显下降、大便糊状、便血等症状，DAI 显著升高（P<0.01）；与模型组相比，各治疗组小鼠DAI 显著降低（P<0.01，P<0.05，图1B）。

图1 各组小鼠体重、DAI变化Fig 1 Weight and DAI changes of mice in each group

2.2 结肠病变和脾脏指数 与正常组相比，模型组小鼠由于炎症、水肿等病变，结肠显著缩短（P<0.01），与模型组相比，各治疗组小鼠结肠缩短现象改善（P<0.01，P<0.05，图2）。模型组小鼠结肠组织肿瘤生长密集，数量较多，肿瘤间距小；与模型组相比，DHMD治疗组小鼠结肠组织肿瘤数、间距、大小均有一定改善（P<0.05），中剂量组变化最为显著（图3）。

图2 小鼠结肠长度变化Fig.2 Changes of colon length in mice

图3 小鼠结肠肿瘤生长情况Fig.3 Tumor growth in colon of each group

2.3 脾脏指数测定 与正常组相比，模型组小鼠脾脏明显肿大（P<0.01）；与模型组相比，各用药组小鼠脾脏肿大得到改善，其中美沙拉嗪和DHMD 中剂量组治疗效果最好（P<0.01，图4）。

图4 各组小鼠脾脏指数Fig.4 Spleen index of each group

2.4 血清 IL-1β、IL-6、IL-10 和 TNF-α 水平 与正常组相比，模型组小鼠血清IL-1β、IL-6 及TNF-α 含量明显升高，IL-10 含量显著降低（P<0.01）；与模型组相比，DHMD 各剂量组和美沙拉嗪可有效降低IL-1β、IL-6及TNF-α含量，提高IL-10含量，DHMD 中剂量组和美沙拉嗪组效果最好（P<0.05，P<0.01，图5）。

图5 小鼠血清细胞因子水平Fig.5 Serum cytokines levels of mice

2.5 结肠组织病理学情况 正常组小鼠结肠形态基本正常，黏膜及腺体未见明显损伤，存在大量杯状细胞；与正常组相比，模型组结肠黏膜严重损伤，腺体结构几乎消失，杯状细胞接近于消失，类似腺瘤组织表现；美沙拉嗪组和DHMD 高、低剂量组肿瘤形成少许减缓，与模型组相比，均呈现不同程度组织增生，黏膜不同程度破坏，组织腺体结构尚存但有不同程度损伤，排列紊乱，杯状细胞减少；DH‑MD 中剂量组死亡率显著降低，相比于模型组各种病变得到改善，结肠组织呈严重炎症状态，黏膜腺体结构轻微损伤但排列整齐，未见明显增生现象，存在明显炎症浸润（图6）。

图6 小鼠结肠组织病理学特征（HE，×200）Fig.6 Histopathological features of mouse colon（HE，×200）

2.6 免疫组化检测结果 如图7所示，正常组小鼠结肠组织仅有少量棕黄色颗粒，TLR4 表达极少；与正常组相比，模型组存在大量棕黄色和褐色颗粒，TLR4 表达提高；与模型组相比，各用药组棕黄色和褐色颗粒明显减少，提示美沙拉嗪和DHMD 对TLR4表达具有抑制作用，DHMD中剂量组降低最为明显（P<0.05，P<0.01）。正常组小鼠结肠组织上MyD88表达极少；与正常组相比，模型组IHC图片上存在棕、褐色颗粒较多，表明MyD88 表达水平较高；与模型组相比，各用药组棕、褐色颗粒明显变少，证明用药后结肠MyD88 表达不同程度降低，DHMD 中剂量组和美沙拉嗪组棕、褐色颗粒减少最为明显，降低MyD88 表达效果最好（P<0.05，P<0.01，图7）。NF-κB-p65 在正常组小鼠结肠组上仅有少量表达，即NF-κB-p65 表达极少；与正常组相比，模型组IHC图片上棕黄色和褐色颗粒骤然剧增，即NF-κB-p65表达水平较高；与模型组相比，用药治疗后，各组棕黄色和褐色颗粒有一定减少，表明各用药组NF-κB-p65 表达不同程度降低，而DHMD 中剂量组降低作用最为明显（P<0.05，P<0.01，图7）。

图7 结肠组织中 TLR4、MyD88、NF-κB-p65 表达（IHC，×400）Fig.7 Expressions of TLR4，MyD88，NF-κB-p65 in each group（IHC，×400）

2.7 蛋白水平检测结果 与正常组相比，模型组小鼠结肠组织内TLR4、MyD88、NF-κB-p65 3 种蛋白表达显著升高；与模型组相比，美沙拉嗪与DHMD各用药组3 种蛋白表达均有不同程度降低，其中DHMD中剂量组降低最为显著（图8）。

图8 小鼠结肠组织中相关蛋白表达Fig.8 Expressions of related proteins in colon tissues of mice

3 讨论

UC 与CAC 密切相关，且UC 患者普遍年龄较小，部分发生癌性病变。一般患者被诊断为UC 后8~10年演变为CAC的风险开始增加，可能原因为诊断时年龄偏低，持续时间较长，结肠受损范围变大，炎症程度加重，但具体机制尚不清楚。PARANG等［9］采用 AOM/DSS 法构建 CAC 模型，内窥镜检查发现AOM/DSS 诱导的小鼠结肠上有明显肿瘤生成。另有研究采用同样造模方法，病理学观测发现AOM/DSS 组小鼠腺体排列紊乱，隐窝变形，固有层、黏膜糜蚀，并伴有大量炎症细胞浸润［11］。本研究采用AOM/DSS 诱导CAC 模型，结果显示，小鼠结肠充血且长度缩短，病理学观察显示小鼠结肠组织黏膜破损，隐窝形成，有大量炎症细胞浸润，且有肿瘤生成，病理学检测为结肠腺瘤，表明本研究造模方法与既往文献一致，结肠炎癌转化模型复制成功。

DHMD 出自《金匮要略》，具有行气活血、清热解毒，散结消肿作用。现代医学认为其可治疗急性阑尾炎、胰腺炎和慢性肠道炎症。沈丽娟等［12］研究DHMD 对脓毒症大鼠急性肠功能障碍的治疗作用与调控肠道髓系细胞触发受体-1（TREM-1）表达的关系发现，DHMD 治疗后血清 TREM-1、TNF-α 浓度显著下降。另有研究发现DHMD 可通过调节TLR/MyD88/NF-κB-p65 信号通路治疗急危重症患者急性肠功能障碍［13］。本研究发现，DHMD 可降低IL-1β、IL-6、TNF-α 细胞因子水平，改善慢性肠道炎症症状，减少肠道肿瘤生成数和大小，说明DHMD 可能具有抑制CAC 作用。此外，美沙拉嗪是已经用于临床的消炎药，可抑制引发炎症的PG和LT形成，对UC 与CD 疗效较好。本研究CAC 模型不同于经典CRC，是由结肠炎不断加深放大转变形成，而美沙拉嗪可治疗UC，因此，本文采用其作为阳性对照药物探究DHMD对炎癌转化的抑制作用。

炎-癌转换涉及机制较为复杂，本研究中涉及的“依赖MyD88途径”的TLR4信号传导通路中，NF-κB活化是中枢环节，NF-κB活化可促进炎症因子释放，而释放的炎症因子又可反过来促进NF-κB 活化，形成正反馈过程，导致炎症不断放大加深，进而恶化为肿瘤；另外，NF-κB 活化可促进细胞增殖，提高癌变细胞存活率和生长率，表明NF-κB持续活化与炎-癌转换密切相关。研究发现，香菇多糖可通过降低促炎症细胞因子IL-13 和CD30L 释放，抑制TLR4/NF-κB 信号传导导致肿瘤数和非典型增生减少，炎症细胞浸润减轻［14］。RAFA 等［15］发现可通过调控LPS/TLR4/NF-κB 信号通路调节 NOS2 和 TNF-α 表达起一定CAC 防治作用。研究发现，托洛司琼治疗可通过降低IL-1β、TNF-α、TLR4 和MyD88 水平减弱结肠炎中的炎症反应抑制 CAC 发展［16］。DHMD 具有一定抗炎作用，其对肿瘤发生的作用鲜有报道。但其单体或单味药的抗肿瘤作用未见报道。ZHANG等［17］研究发现，丹皮酚在体外和体内均能抑制人膀胱癌，可能通过抑制PI3K/AKT 信号通路发挥作用。研究发现，大黄素可与5-氟尿嘧啶联合用药加强抗癌作用，通过下调PI3K/Akt信号通路降低CRC 对 5-氟尿嘧啶的耐药性［18］。本研究发现，DH‑MD 降低组织中TLR4、MyD88和NF-κB-p65表达，说明其抑制炎癌转化可能与其抑制TLR/MyD88/NF-κB-p65 通路有关。目前国内外有关DHMD 对肿瘤作用的研究鲜有报道，因DHMD 对肠道炎症疗效较好，另一方面CAC 发展进程为“正常-炎症-增生-癌症”，炎症发展对CAC 形成具有重要作用，因此，治疗炎症阻断炎癌转化链是本研究选择DHMD 的重要原因。此外，本研究因时间因素影响，尚未完成体外实验验证，故实验结论具有一定局限性，后续将深入验证DHMD对CAC和相关信号通路的影响。