IL-33在结肠癌患者中的表达水平及临床研究

王红敏 郭 瑛（北京市垂杨柳医院，北京100022）

结肠癌是一种临床常见消化系统的恶性肿瘤，随着近些年人们生活水平的逐渐提高以及人类饮食结构的改变，结肠癌的发生率、死亡率均明显升高，在消化系统恶性肿瘤中，结肠癌的发病率已跃居第三位，且该病的5年生存率仅为50%［1-2］。目前，对于结肠癌的治疗，临床主要有手术、化疗、放疗及分子靶向治疗等方式，随着肿瘤及免疫学研究进展，有望发现结肠癌新的治疗措施［3］。IL-33是近年发现的IL-1家族的一种新成员，由于其最早发现于小静脉高壁内皮细胞，所以又称为“高壁内皮细胞来源的核因子”［4］。有研究证实在多种慢性炎症发病过程中，IL-33表达明显增强，在多种恶性肿瘤（如卵巢癌、肺癌、乳腺癌及结肠癌等）的发病过程中，IL-33也高度表达，在肿瘤的临床诊断及评估预后中也是重要标志物，同时还有研究人员发现IL-33在抗肿瘤反应中起诱导作用，可称为新的抗肿瘤抑制剂［5-7］。可见，IL-33是一种双功能蛋白，既是一种诱发炎症反应的细胞因子，又是可调控转录的细胞核因子［8］。本次研究的目的在于探讨结肠癌患者其外周血内IL-33水平及其相关的临床意义。

1 资料与方法

1.1 资料 纳入2016年1月至2017年12月我院收入治疗的结肠癌患者进行研究。纳入标准：患者经临床病理诊断后确诊是结肠恶性肿瘤，病理类型均为结肠腺癌；患者既往无神经系统疾病、严重的器质性疾病及心理精神等疾病。排除标准：结肠恶性肿瘤的病理类型属于神经内分泌肿瘤或其他类型，不属于结肠腺癌的患者；出现严重的肝肾功能损伤或机体内环境紊乱者；近期曾服用精神类药品或对药物有过度依赖者；研究过程中自动退出者。根据上述标准，共纳入110例结肠腺癌患者作为观察组，同时选择同期来我院健康体检的100名成年人作为对照组。本研究已通过我院医学伦理委员会的审议，患者及其家属签署本次研究知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 收集两组成员基本临床资料（性别、年龄等），观察组按照Ducks癌症分期标准，A～B期63例，C～D期47例；根据国际抗癌联盟及美国癌症联合委员会制定的癌症TNM分期标准，Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期58例；有淋巴转移者49例，无淋巴转移者61例。根据观察组结肠腺癌的分化程度进行分级，若腺上皮细胞呈管状/乳头状排列，且未见明显的异性细胞，核分裂较少，为高分化（29例），若肿瘤细胞的排列呈实质状/片状，仅见灶性的腺样组织结构，见明显的异性细胞、核分裂较多且有坏死，为低分化（37例），介于以上两种分化程度的为中分化（44例）。观察组分为3个亚组，即高分化组29例、中分化组44例、低分化组37例。

1.2.2 ELISA和免疫组化实验检测IL-33水平及IL-33、IFN-γ、IL-4表达的数目 抽取观察组与对照组的空腹静脉血各5 ml，采用ELISA检测外周血中IL-33水平。观察组接受手术切除治疗，术中切取肿瘤病理组织，制作切片并分别进行免疫组化染色，染色后进行封片，在显微镜下观察，以500个细胞为1个计数单位，记录其中IL-33、IFN-γ、IL-4呈阳性表达的数目。在结肠癌的肿瘤组织内，上述几种细胞因子呈阳性的细胞主要在细胞质内表达，呈现浅黄色或者棕黄色。具体计分标准：细胞未染色者为0分，细胞呈较少的淡黄色为1分，细胞呈较多的棕黄色为2分，细胞呈大量的深棕色为3分。在显微镜下观察时，每500个细胞视野内，染色细胞数＜30%者记1分，30%≤染色细胞数＜76%者记2分，染色细胞数≥76%者记3分。以上两项得分相乘，0分者为“-”，1～4分者为“+”，大于4分者为“++”，“-”为IL-33阴性，“+”及“++”为IL-33阳性。

1.2.3 观察组患者术后随访 对观察组患者术后进行为期2年的随访，统计观察组患者不同TNM分期术后2年的死亡率，对影响结肠腺癌患者预后的因素进行Logistic回归分析。

1.3 统计学分析 本项研究中的相关数据应用SPSS22.0统计学软件处理及分析。经检测，本研究中所有计量资料均符合正态分布，计量资料以±s的形式表示，比较时使用t检验法；计数资料进行比较采用χ2，多因素回归分析使用Logistic法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 比较两组患者的临床相关资料及血清IL-33水平 两组患者性别、年龄均差异无统计学差异（P＞0.05），观察组血清IL-33水平为（44.23±11.31）pg/ml，明显高于对照组（28.35±7.86）pg/ml，P=0.000，差异具有统计学意义，见表1。

表1 两组患者的临床相关资料及血清IL-33水平（±s）Tab.1 Clinical data and serum IL-33 level were compared between two groups（±s）

表1 两组患者的临床相关资料及血清IL-33水平（±s）Tab.1 Clinical data and serum IL-33 level were compared between two groups（±s）

Groups Observation Control t/χ2 P n 110 100 Gender（male/female）56/54 52/58 0.291 0.590 Age（year）57.28±6.55 58.71±6.39 1.590 0.111 IL-33（pg/ml）44.23±11.31 28.35±7.86 11.703 0.000

2.2 比较观察组血清IL-33水平与结肠腺癌临床病理特征相关性 观察组血清IL-33水平与患者的年龄、性别无关，与肿瘤病理分期及淋巴结转移有关，T3～4期的IL-33水平明显高于T1～2期（P＜0.05），TNMⅢ～Ⅳ期的IL-33水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），有淋巴结转移的IL-33水平明显高于无淋巴结转移（P＜0.05），见表2。

表2 观察组血清IL-33水平与结肠腺癌临床病理特征相关性（±s）Tab.2 Correlation between serum IL-33 level and clinicopathological characteristics of colon adenocarcinoma in observation group（±s）

表2 观察组血清IL-33水平与结肠腺癌临床病理特征相关性（±s）Tab.2 Correlation between serum IL-33 level and clinicopathological characteristics of colon adenocarcinoma in observation group（±s）

Clinicopathological characteristics Age（year）＜60≥60 Gender Male Female Tstage T1～2 T3～4 TNMstageⅠ～ⅡⅢ～ⅣLymph node metastasis Yes No n 48 62 56 54 59 51 52 58 49 61 IL-33（pg/ml）45.48±9.16 42.34±8.24 48.32±8.71 46.05±8.63 38.18±7.62 45.35±8.44 40.31±9.17 46.47±8.62 45.88±5.92 43.19±6.27 t 1.888 1.373 4.682 3.631 2.307 P 0.062 0.173 0.000 0.000 0.023

2.3 免疫组化检测观察组不同病理特征患者IL-33表达水平 免疫组化法检测观察组肿瘤组织IL-33阳性表达细胞数，发现肿瘤分化程度较低、临床分期较高的患者肿瘤组织中IL-33阳性表达数目较高，见表3。

表3 免疫组化检测观察组不同病理特征患者IL-33表达水平（±s）Tab.3 Expression levels of IL-33 in patients with different pathological characteristics were detected by immunohistochemistry（±s）

表3 免疫组化检测观察组不同病理特征患者IL-33表达水平（±s）Tab.3 Expression levels of IL-33 in patients with different pathological characteristics were detected by immunohistochemistry（±s）

Note：Compared with high differentiated tumors，1）P＜0.05；compared with low differentiated tumors，2）P＜0.05.

Pathological characteristics Degreeof tumor differentiation Low differentiation Moderatedifferentiation High differentiation Tstage T1～2 T3～4 Nstage N0 N1～2 TNMstageⅠ～ⅡⅢ～Ⅳn 37 44 29 59 51 67 43 52 58 IL-33 positive cell number 4.94±2.31 3.19±2.11 2.15±1.39 2.45±1.62 4.17±2.37 2.11±1.70 3.99±.23 2.47±1.72 4.27±2.14 t 5.736 2.338 4.492 5.002 4.731 P 0.0002）0.0001）0.000 0.000 0.000

2.4 免疫组化检测观察组3个亚组IL-33、IL-4、IFN-γ表达水平比较 观察组3个亚组中IL-33、IL-4表达水平为低分化组＞中分化组＞高分化组（P＜0.05），IFN-γ表达水平无明显差异（P＞0.05），见表4。

表4 免疫组化检测观察组3个亚组IL-33、IL-4、IFN-γ表达水平比较（±s）Tab.4 Comparison of expression levels of IL-33，IL-4 and IFN-γin three subgroups of observation group by immunohistochemistry（±s）

表4 免疫组化检测观察组3个亚组IL-33、IL-4、IFN-γ表达水平比较（±s）Tab.4 Comparison of expression levels of IL-33，IL-4 and IFN-γin three subgroups of observation group by immunohistochemistry（±s）

Note：Compared with high differentiated tumors，1）P＜0.05；compared with low differentiated tumors，2）P＜0.05.

Groups Low differentiation Moderate differentiation High differentiation n 37 44 29 IL-33 positive cell number 4.94±2.311）3.19±2.112）2.15±1.39 IL-4 positive cell number 10.84±2.02 1）8.36±1.80 2）6.02±1.05 IFN-γpositive cell number 24.81±5.43 24.66±4.80 25.40±5.61

2.5 术后2年随访并统计观察组患者死亡率 术后2年随访发现，观察组肿瘤组织病理分期越高的死亡率越高，见表5。

表5 术后2年随访并统计观察组结肠腺癌患者死亡率［例（%）］Tab.5 Mortality rate of patientswith colorectal adenocarcinoma in observation group was statistically analyzed after 2 years of follow-up［n（%）］

2.6 影响结肠腺癌患者预后的多因素回归分析Logistic多因素回归分析，IL-33水平是影响结肠腺癌患者预后的独立危险因素，见表6。

表6 影响结肠腺癌患者预后的多因素回归分析Tab.6 Multivariate regression analysisof prognosis in patients with colon adenocarcinoma

3 讨论

IL-1家族新成员IL-33在巨噬细胞、上皮细胞、肥大细胞及内皮细胞等多种细胞中均可表达，当机体细胞受损时会有大量IL-33生成，IL-33亦称“警戒素”，在多种慢性炎症，如关节炎、结肠炎、哮喘等发病过程中大量表达［9］。由于细胞类型的差别，IL-33可诱发多种炎症反应，如IL-33诱导机体肥大细胞产生IL-4、IL-5、IL-6等多种细胞因子，诱导Th2淋巴细胞生成IL-5和IL-13等细胞因子［10-11］。大量研究证实，机体慢性炎症与肿瘤的发病具有相关性，在肿瘤发生的炎症微环境中，IL-33是主要成分并可进一步诱发肿瘤［12-13］。有研究人员在乳腺癌动物模型中发现IL-33诱导IL-10、IL-13及调节性T细胞（Treg）的生成，加重肿瘤的发展浸润［14］；在胃癌动物模型中，IL-33增加IL-6及金属蛋白酶（MMP-3）的分泌，诱发癌细胞浸润转移［15］。

本研究对比结肠癌患者与健康人血清中IL-33水平，发现IL-33在结肠癌患者中表达明显升高；血清IL-33水平在不同年龄、不同性别的结肠癌患者之间无显著差异；根据结肠癌患者肿瘤分化程度及TNM分期不同，进一步比较亚组患者血清中IL-33水平，发现肿瘤分化程度较低、临床病理分期较高的患者血清IL-33明显升高。免疫组化法对观察组结肠癌患者的肿瘤组织进行检测，发现随着结肠癌患者肿瘤组织的分化程度降低、临床病理分期较高的患者肿瘤组织中IL-33阳性表达数目较高。术后2年随访发现，肿瘤组织病理分期较高的死亡率随之增高。

恶性肿瘤的发生与机体免疫系统Th1/Th2细胞失衡有关，肿瘤细胞的分化可抑制Th1型细胞因子的分泌、促进Th2型细胞因子的生成，导致免疫逃逸及Th1/Th2失衡［16］。关于IL-33在机体免疫系统中发挥作用的相关研究，发现IL-33是促进Th2型细胞因子生成的诱导剂，IL-33可抑制钙黏蛋白在肿瘤细胞间的表达，并对肿瘤血管内皮细胞分化、增殖具有较强的刺激作用，促进血管的形成［17-18］。ST2是一种在Th2细胞中大量表达的IL-33受体，有研究发现IL-33由IL-33/ST2L信号通路诱导恶性肿瘤的发生，同时激活自然杀伤性细胞相关通路、促进Th2型细胞因子的表达［19-20］。Th1型细胞因子主要有IFNγ、IL-12，Th2型细胞因子主要有IL-4、IL-10等。为进一步研究和探讨IL-33引发结肠癌的免疫学机制，本研究发现，IL-33、IL-4表达水平随观察组患者分化程度的不同而有明显差异，IL-33、IL-4表达水平为低分化组＞中分化组＞高分化组。可见，分化程度越低的结肠癌患者，IL-33、IL-4表达水平越高，IL-33促进Th2型细胞因子的分泌及Th1/Th2失衡，与前人研究一致。

综上，本研究发现在结肠癌患者外周血中IL-33水平明显升高，IL-33与结肠癌病情程度呈正相关，IL-33的检测对结肠癌的诊断具有积极意义，但是，近年随着对IL-33研究的深入，发现IL-33能诱导机体CD8+T细胞分泌IFN-γ，提高机体免疫应答反应，对肿瘤的监测及抑制具有积极作用，有学者在肺癌动物模型体内发现IL-33的表达能抑制肿瘤细胞的生长及转移［19-20］。关于IL-33在肿瘤中作用的相关研究目前尚未有定论，在不同的肿瘤组织中，IL-33发挥的作用不同，仍有待进一步的研究。