人卵巢组织玻璃化冷冻技术研究进展

李 淼,李 梅

(山东大学生殖医学研究中心 国家辅助生殖与优生工程技术研究中心 生殖内分泌教育部重点实验室山东省生殖健康临床医学研究中心 山东大学附属生殖医院，济南 250012)

疾病诊断治疗技术的不断发展极大提高了恶性肿瘤患者的生存率，生存期也在逐年延长。以手术治疗为主，放、化疗技术为辅的恶性肿瘤治疗方式会对女性患者的卵巢组织造成损伤，而卵巢组织的损伤一旦发生就不可逆转。损伤后的卵巢组织丧失内分泌及正常排卵功能，造成患者无法自然妊娠，治疗后生活质量严重下降。根据WHO统计数据，全世界范围内每年新增41.7万例儿童青少年(0～19岁)恶性肿瘤患者[1-2]。对于青春期前的女性肿瘤患者，卵巢组织冷冻是唯一适合的生育力保存方法。冻融后的卵巢组织移植回患者体内可恢复相应的内分泌功能，恢复月经周期，提高治疗后生活质量。即使不能移植回体内，保存的原始卵泡也有望通过体外成熟培养技术和辅助生殖技术帮助患者生育属于自己的遗传学后代[3]。

卵巢组织冷冻是女性生育力保存的重要方式，而冷冻技术是低温保存成功与否的关键，提高冷冻保存效率，提高卵泡存活率一直是低温生物学研究的重中之重。现就卵巢组织玻璃化冷冻相关文献进行综述分析。

1 卵巢组织冷冻保存的发展概况

早在20世纪50年代，人们就开始了卵巢组织冷冻技术的研究。2004年，比利时学者Donnez首次报道了冷冻卵巢组织成功获得临床分娩，1例柯杰金淋巴瘤患者在卵巢组织冷冻复苏自体移植后成功活产一婴儿[4]。截止目前，已报道卵巢组织冷冻复苏移植后出生的婴儿至少130例[5]，其中5例为玻璃化冷冻组织移植后获得[6-7]。

程序化慢速冷冻技术在冷冻保存卵巢组织的应用中已相对成熟，但有操作复杂、易形成冰晶造成冷冻损伤、依赖于昂贵仪器等缺点。随着低温生物学的发展，更有效的冷冻保护剂出现，使得卵巢组织冷冻技术得到进一步发展，如玻璃化冷冻技术的出现。玻璃化冷冻的优势是快速、便捷，冷冻过程中不形成冰晶。过去几十年，大量研究表明玻璃化冷冻技术是一种有效的卵巢组织冷冻技术，但仍有许多待完善的细节[8-11]。玻璃化冷冻技术在冷冻保护剂的种类以及浓度、平衡时间、冷冻方法、冷冻载体等诸多细节方面需进一步完善[9]。找到一个统一标准、高效的玻璃化冷冻方案成为低温生物学家及临床实验室共同努力的目标。

2 卵巢组织玻璃化冷冻

2.1 常用冷冻保护剂 一般冷冻保护剂分为两大类：渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。常见的渗透性保护剂有乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)、二甲基亚砜(DMSO)等，可透过细胞膜进入细胞质。非渗透性保护剂包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖等大分子物质，不能进入细胞内。玻璃化冷冻保护剂常选用上述两类保护剂同时使用，如EG、DMSO和蔗糖等[11]。

2.2 玻璃化冷冻方法及效果评价 玻璃化是指水或冷冻保护剂快速降温而形成的一种介于固态、液态之间的高黏度、非晶态的玻璃化状态。玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体状固体状态。这一状态的变化无冰晶形成，，避免了冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，但是高浓度的保护剂会对细胞产生一定毒性。保护剂的渗透效率很大程度上决定了冷冻效果，因此组织大小、保护剂浓度、平衡时间等因素是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。目前文献报道中大部分卵巢皮质组织被处理成厚约1～2mm的片状组织[8-11]。

Fabbri等[10]采用程序慢速降温冷冻和玻璃化冷冻(2mol/LPROH、3mol/L EG、0.2mol/L蔗糖、15% HSA 4℃平衡30min，3mol/LPROH、5mol/LEG、0.5mol/L蔗糖、15% HSA 4℃平衡30min后放入液氮)两种方法冻存6例患者卵巢组织，复苏后分别进行形态学观察并比较，发现玻璃化组的卵泡以及基质细胞的细胞形态、亚细胞结构优于程序冷冻组。Zhao等[11]发现，玻璃化组间质细胞凋亡低于程序冷冻组，而两组的初始卵泡形态学、卵泡凋亡率无显著差异。但是，张娜等[12]检测血管生成素-2(Ang-2)表达，探讨两种冷冻方法对人卵巢组织的冻融及异种移植后的效果，发现与玻璃化冷冻相比，程序化冷冻对人卵巢组织始基卵泡颗粒细胞Ang-2的表达影响更小。由于卵巢组织细胞的多样性、玻璃化冷冻方案不同等原因，需大量实验系统地比较两种冷冻方法，完善玻璃化冷冻细节。

玻璃化冷冻方法大致分为两步：平衡和冷冻。Chang等[13]仅用20% EG作为冷冻保护剂，室温下分别平衡5min、10min、20min后玻璃化冷冻，复苏后观察比较卵泡、基质细胞形态学结果，发现10min组优于其它两组。此外，Keros等[14]对平衡时间(5、10min)亦做了相关研究，10min组各种细胞存活率以及形态学表现优于其它组。由此可见，平衡时间影响玻璃化冷冻效果，平衡10min可使保护剂充分渗透进入组织细胞内又不会造成严重的细胞毒性损伤。

Xiao等[15]研究了相同的平衡条件、相同的保护剂成分(EG、DMSO、蔗糖)下，不同的浓度(15%、13.5%、12%)对玻璃化冷冻结果的影响，结果表明运用浸润针作为载体，12%低浓度组的组织形态学结果、细胞凋亡水平、组织损伤程度等方面优于高浓度组。同时，Zeng等[16]采用低浓度的冷冻保护剂(1.5mol/L EG、1.5mol/LDMSO、0.5mol/L蔗糖)玻璃化冷冻人卵巢组织，发现复苏后组织具有更完整的形态学结构、较高卵泡存活率、低细胞凋亡率，可更好地保存组织。此外，韩莹等[17]提出了低浓度的DMSO联合EG作为保护剂冻存卵巢组织、对卵巢组织损伤最小的观点。由于EG具有较低的细胞毒性和较高的渗透效率等特性，常被用作玻璃化冷冻保护剂。合适的冷冻保护剂可良好地保存组织生物形态以及生理功能，最大程度降低冷冻损伤。

目前用于玻璃化冷冻的载体种类有很多，大致分为封闭式和开放式。封闭式载体可避免组织直接接触液氮，但降温速率较慢。常用的玻璃化冷冻载体多为开放式，组织与液氮直接接触，可实现快速降温，但是存在液氮污染的风险。适宜的冷冻载体可以提高热交换速率，减少玻璃化冷冻液体积，使组织块迅速、均匀地降温，同时又能减少冷冻保护剂用量以降低细胞毒性。为了改善玻璃化冷冻效果、提高降温速率，学者们比较了多种冷冻载体的冻存效果。Amorim等[18]采用两种不同冷冻载体(预冷的固体表面和麦管)玻璃化冷冻7例患者的卵巢组织，分别比较研究组织形态学、细胞增殖和凋亡等方面，上述两种载体均能有效的保存各阶段卵泡并实现卵泡再发生，但麦管组更能完好地保存初始卵泡。郑轶等[19]亦做了相关研究，比较3种不同载体(针浸润玻璃化冷冻组、表面玻璃化冷冻组和直接覆盖玻璃化冷冻组)对卵巢组织玻璃化冷冻的影响，形态学统计始基卵泡存活率(分别为88.14%，80.00%，81.25%，P>0.05)，三种载体均能较好地保存卵巢组织，但针浸润组的冻存效果明显优于其它两组。针浸润载体是目前最常用的开放式载体。

玻璃化冷冻成功的关键在于保护剂渗透效率、细胞毒性及降温速率。保护剂浓度、平衡时间、样本组织大小及厚度与保护剂渗透效率密切相关。目前玻璃化冷冻方法多采用低浓度冷冻保护剂DMSO、EG联合蔗糖平衡1～2mm厚度的皮质组织10min，去除多余平衡液后，使用针浸润载体放入液氮内冷冻保存。

3 冷冻效果评价方法

3.1 组织学观察 卵巢组织的组织学观察是指新鲜或冻融后的卵巢组织经固定，制成切片，染色后于光学显微镜下观察其组织结构、卵泡形态，比较冻融前后不同阶段卵泡分布比例及其结构的变化，是直接有效地显示卵巢组织细胞结构完整性的指标。此外，根据相关评分规定对卵泡形态进行评定[14]，卵母细胞与颗粒细胞无明显退化，颗粒细胞排列规则、无脱落，基底膜完整则被认为是完整的卵泡。最常用的组织染色是苏木精-伊红染色，其操作简单，指示准确，可观察卵细胞的各种形态变化，是使用最广泛的方法。Almodin等[20]观察比较了玻璃化冻融后组织与新鲜组织的卵泡形态，发现两者形态学之间无显著差异。此外，亦有研究发现玻璃化冷冻与程序冷冻两种方法在此方面无明显差别[12,21]。此外，组织经固定后，于透射电镜下可观察细胞内超微结构(细胞核、线粒体、溶酶体等)，即使光学显微镜下显示组织学正常的始基卵泡内仍存在线粒体、内质网肿胀等亚细胞结构损伤。免疫荧光显微镜可通过不同的颜色变化，明显地判定细胞是否存活。光学显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜联合运用可更有效地评判卵巢组织冷冻后组织细胞的形态完整以及功能状态。

3.2 原始卵泡的DNA 碎片细胞内DNA碎片率也是一种评估细胞完整性的方法。Sanfulippo等[22]分析玻璃化冷冻组、慢速冷冻组冻融后组织的原始卵泡内DNA碎片比例(分别为20.8%、31.3%)，并与新鲜卵巢组织(35%，P>0.05)比较，无显著差异。Xiao等[15,23]研究观察发现，玻璃化冷冻的卵泡内DNA片段完整性高于慢速冷冻。基于DNA片段完整性此项标准，目前尚无法明确评判玻璃化冷冻与慢速冷冻孰优孰劣，仍需大量样本进行研究。

3.3 移植卵巢 移植的目的是重新启动卵泡的生长发育，恢复内源性性激素的周期性释放，恢复卵巢功能，恢复患者生育能力。卵巢移植大致有两种方式：一种是无血管吻合的卵巢组织移植，操作简便；另一种是带血管蒂的卵巢移植，手术过程复杂，微血管吻合技术要求高。目前多采用无血管吻合的卵巢组织皮质片移植。根据移植位置，卵巢组织移植又分为异位自体移植和原位移植。目前，2例患者异位移植卵巢组织并成功活产，其他活产患者均为原位移植[22]。异位移植多数移植于腹膜袋内，靠近输卵管端，组织的皮质面面向腹腔，有利于后期卵子成熟并排出。2000年,Oktay[24]报道了第1例异位移植于腹膜袋患者，15周后卵泡生长并排卵。2004年Donnez等[4]报道了冻融后卵巢组织原位移植后成功实现活产。Suzuki等[7]玻璃化冷冻POI患者卵巢组织，复苏后自体移植，2例成功活产。冻融后的卵巢组织移植后能恢复内分泌功能、实现卵泡生长是评价冷冻方法至关重要的标准。针对肿瘤患者而言，卵巢组织移植存在肿瘤细胞再种植的风险。冻存前应对组织进行充分的组织学、免疫学及分子生物学技术的检测评估。

3.4 中性红染色 中性红染色液(0.1%，常规染色)是一种组织或细胞染色时常用的可将细胞核染成红色的染色液，常用于组织或细胞染色中细胞核的红色复染。中性红作为活细胞染料可很好地检测卵巢组织中卵泡的存活情况，有利于直观快速评价移植前的卵巢组织卵泡存活状态。新鲜或冷冻复苏后的卵巢组织用切片机切割，切至泥状，中性红染色后在倒置显微镜下观察。相比于台盼蓝，只能对死细胞进行染色，中性红染色更能直观表现组织细胞的存活率，并对组织细胞后续生长发育无损伤[25]。

除上述方法外，我们还可采用放射性免疫法或电化学发光法监测冻融后的卵巢组织在体外培养液中E2、P、T等内分泌激素浓度的变化，以此来揭示卵巢组织内分泌功能是否恢复，是卵巢组织功能正常的间接指示。从冻融后的卵巢组织内分离出卵泡，体外培养一段时间后观察其发育生长情况是评价冷冻效果的重要指标。上述两种方法均存在培养周期较长的缺点。此外，细胞凋亡DNA检测，如TUNEL，亦是卵巢组织移植的重要指标之一。目前评价卵巢组织冷冻效果的方法很多，选择直观简单有效的方法可缩短实验周期。

4 小 结

目前，玻璃化冷冻具有快捷便利、操作简单、成本低廉等优点，在卵巢组织冻存方面应用越来越广泛。研究表明，玻璃化冷冻比慢速冷冻更有利于保存卵巢组织，但仍存在待完善的问题。需探索一套规范高效安全的冷冻方案，进一步开展玻璃化冷冻的应用及研究，针对卵巢组织的移植及体外培养进行更广泛深入的研究，以为临床应用提供更多有力的证据。随着冷冻技术的不断发展，卵巢组织玻璃化冷冻方案必定趋于完善，未来也必定有更广阔的应用前景。