小豆幼苗对低温胁迫的生理应激及烯效唑的缓解效应

项洪涛，李 琬，何 宁，刘 佳，王诗雅，王曼力，王彤彤，杨纯杰

(1. 黑龙江省农业科学 院耕作栽培研究所，哈尔滨 150086；2. 黑龙江省农业科学院 植物保护研究所，哈尔滨 150086；3.黑龙江八一农垦大学 农学院，黑龙江 大庆 163319)

小豆(Vignaangularis)是喜温喜光不耐冷、短日照作物，是我国重要的食用豆类作物之一，近年来种植面积逐渐增加。小豆对温度敏感，最适生育温度为20～24℃，低于该温度即发生低温胁迫甚至产生冷害[1]。低温影响植物生长和代谢，使植株体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基大量积累，未被及时清除的ROS积累在植物体内，导致植物细胞膜脂过氧化伤害[2]，影响作物正常的理化代谢功能和途径。李海燕等[3]研究表明，低温胁迫使H2O2含量显著增加，低温时间越长，增加趋势越明显。张爱冬等[4]也指出，随着温度降低，植物叶片H2O2含量呈上升趋势，促使细胞膜透性增大，胞内电解质外渗，加剧膜质过氧化作用。项洪涛等[5]指出，低温导致植物体内MDA含量增加，并随胁迫强度和胁迫时间而增多。邓化冰等[6]也得出相似结论，认为低温导致植物叶片MDA含量显著增加，加剧膜质过氧化程度，导致膜结构破坏，质膜透性加大，电解质外渗，从而影响叶片的生理生化机能。

烯效唑(uniconazole)，简称S3307，是一种具有广谱、高效、低毒、低残留特点的植物生长延缓剂，S3307有提高作物产量的作用，常被用在调控作物生长发育、增强抗逆性的等方面[7]。相关研究表明，低温条件下，S3307能显著提高秋茄幼苗的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性[8]，可以显著提高水稻渗透调节物质含量[5]，显著降低绿豆ROS类物质以及丙二醛(MDA)的积累[9]，显著提高大豆的产量[10]。综上可以看出S3307能够有效缓解作物的低温胁迫，但鲜有关于S3307提高小豆幼苗抗性的报道。叶片是小豆重要的光合器官，起到合成并供给同化产物的重要作用，当小豆受到低温胁迫时，叶片生理代谢会受到阻碍并影响幼苗建植，最终导致产量下降。因此本试验于幼苗期对小豆进行低温处理，开展低温胁迫及预喷施S3307对小豆叶片抗逆生理及产量的影响研究，旨在分析S3307缓解小豆苗期低温的作用，丰富东北地区小豆抗冷技术工程体系，为小豆耐冷栽培、高产优质生产提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小豆品种为耐冷品种龙小豆4号和冷敏品种天津红，材料由国家食用豆产业技术体系芸豆育种岗位专家魏淑红研究员馈赠。

供试植物生长调节剂为烯效唑(S3307)，由黑龙江八一农垦大学化控研究中心提供。

1.2 试验设计

试验在黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所盆栽场及人工气候室内进行。采用盆栽方式，试验用盆高30 cm、直径25 cm，每盆装自然风干壤土7.0 kg，播种后覆土200 g，每盆保苗15株(5穴×3株)。试验用土取自哈尔滨市道外区民主乡，土壤类型为草甸黑土。供试土壤的理化性质：土壤容重约1.72 g·cm-3，最大田间持水量约25.65%，有机质含量2.63%、全氮1.46 mg·g-1、全磷0.66 mg·g-1、缓效钾325.7 mg·kg-1、碱解氮165.0 mg·kg-1、速效磷41.25 mg·kg-1、速效钾156.7 mg·kg-1、土壤pH6.69。4月18日播种(阳光型人工气候室内播种，哈尔滨地区4月中旬室外温度相对偏低，不利出苗)，每品种分别播种75桶，选取长势均匀的样本进行试验，试验共设6个处理，每个处理设3次重复，具体设计见表1。

表1 试验设计方案

于幼苗期(4月30日，此时真叶完全展开，第一片复叶露头)进行低温处理，处理温度为恒定4℃。进行低温处理当天上午10∶00，采取叶面喷施方式施用S3307，使用浓度20 mg·L-1，折合用液量22.5 mL·m-2(使用浓度和使用剂量为本课题组前期试验所得)。喷施完毕后，于当晚20∶30进入事先预冷的人工气候室冷房内进行低温处理，持续时间12 h，CK处理温度人工气候室内自然温度(当日夜间温度为17℃)，次日上午8∶30停止低温处理。并进行第一次取样，之后每天上午8∶30顺延进行下一次取样，共取样5 d，记为取样第1天～第5天。

1.3 测定项目与方法

1.3.1取样方法

低温处理后，连续取样5次，每天上午8∶30取样一次，各处理分别进行取样，将小豆植株叶片迅速剪下装入标记好的自封袋内，并立即放入液氮中，而后置于-80℃冰箱中保存，待测生理指标。

1.3.2测定方法

按照李合生等[11]的方法采用氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性、采用分解过氧化氢含量速率法测定过氧化氢酶(CAT)活性、采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)含量，过氧化氢(H2O2)含量的测定采用碘化钾法[12]。

1.4 数据分析

试验所有数据利用Excel2010进行处理和作图，使用DPS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对小豆幼苗叶片膜损伤的影响

2.1.1对叶片H2O2含量的影响

由图1可知，幼苗期低温处理后，小豆叶片H2O2含量快速升高，随着取样时间的延续，小豆叶片H2O2含量呈下降趋势。对龙小豆4号来说，第1天和第2天取样时，H2O2含量均为T2>T1，方差分析结果表明差异达到显著水平；第3天到第5天取样时，T2和T1之间差异减小，差异未达到显著水平。天津红H2O2含量的表现与龙小豆4号一致，说明低温对不同抗性小豆品种影响趋势一致。从图1中可以看出，与T2处理相比，喷施S3307处理龙小豆4号H2O2含量第1天显著降低了6.03%，第2天降低了2.81%；与T4处理相比，喷施S3307处理天津红的H2O2含量第1天和第2天分别显著降低6.51%和8.32%，之后处理间H2O2含量差异不显著，说明低温胁迫下喷施S3307处理能抑制H2O2含量的升高。对于不同抗性品种而言，S3307对冷敏品种天津红的效果更好。

图1 低温胁迫及喷施S3307对小豆幼苗叶片H2O2含量的影响

2.1.2对叶片MDA含量的影响

由图2可知，幼苗期低温处理后，小豆叶片MDA含量明显升高，随着取样时间的延续，MDA含量呈下降趋势。对龙小豆4号来说，第1天到第3天取样时，T2的MDA含量均高于T1，分别高出65.56%、20.75%和7.20%，方差分析结果表明差异达到显著水平；第4天和第5天取样时，T2和T1之间含量差减小，未达到显著差异水平。低温处理对天津红MDA含量影响规律与龙小豆4号相同，但抗性较强的品种龙小豆4号的MDA含量相对较低，说明低温对不同品种小豆叶片MDA含量影响一致，但影响程度上存在差别。对龙小豆4号来说，第1天到第3天取样时，MDA含量均为T3

图2 低温胁迫及喷施S3307对小豆幼苗叶片MDA含量的影响

2.2 低温胁迫及喷施S3307对小豆幼苗叶片抗氧化酶系统的影响

2.2.1对叶片SOD活性的影响

由图3可知，低温处理及喷施后S3307后，小豆叶片SOD活性相应提高，各处理大致呈现先升后降的变化趋势。整体看龙小豆4号的活性高于天津红(T1>T4)，这与其耐冷性强有关。对龙小豆4号来说，第1天到第4天取样时，T2>T1，分别高出6.67%、3.37%、6.64%和8.13%，T2和T1间差异在第4天达到显著水平。对天津红而言，第1天到第4天取样时，T5>T4，分别高出18.48%、18.21%、18.72%和10.24%，差异均达到显著水平；直到第5天差异不显著。说明低温对不同品种小豆叶片内SOD活性影响具有较大影响，对耐冷性较弱天津红影响更大。喷施S3307能进一步提高低温条件下SOD活性，龙小豆4号第1天到第4天取样时，各处理间高低顺序均为T3>T2>T1，其中T3较T2分别提高10.20%、13.03%、11.55%和7.65%，方差分析结果表明T3均显著高于T2和T1。对天津红来说，第1天到第4天取样时，各处理间高低顺序均为T6>T5>T4，其中T6较T5分别提高了17.26%、16.81%、9.05%和13.92%，方差分析结果表明T6均显著高于T5和T4。综合来看，喷施S3307对不同抗性的小豆品种具有相同的调控规律。

图3 低温胁迫及喷施S3307对小豆幼苗叶片SOD活性的影响

2.2.2对叶片POD活性的影响

从图4可以看出，幼苗期低温处理后小豆叶片POD活性增加，随着取样时间的推移POD活性整体大致呈下降趋势。龙小豆4号在第1天到第4天取样时，POD活性均为T2>T1，仅第1天POD活性差异达到显著水平。天津红经低温处理后，第1天到第5天取样时，POD活性均为T5>T4，分别高出102.44%、56.21%、62.13%、31.67%和3.55%，前4天的差异均达显著水平。说明不同抗性品种对低温的感受不同，抗性较弱的天津红对低温更为敏感，其POD活性持续较高，来抵御低温的胁迫伤害，而抗性较强的龙小豆4号叶片内POD活性仅取样第1天显著高于对照，说明其对低温钝感，短时低温对其伤害不大。喷施S3307后，龙小豆4号在第1天到第5天取样时POD活性均为T3>T2，分别高出17.16%、17.78%、4.46%、11.87%和2.08%，前2天的差异达到显著水平。对天津红来说，第1天到第5天全部取样期间，各处理间高低顺序均为T6>T5>T4，方差分析结果表明T6均显著高于T5和T4。整体来看，喷施S3307能进一步提高低温条件下POD活性，对天津红的POD活性具有更加明显的调控效应。

图4 低温胁迫及喷施S3307对小豆幼苗叶片POD活性的影响

2.2.3对叶片CAT活性的影响

由图5可知，幼苗期低温处理后，小豆叶片内CAT活性呈下降的变化趋势。各取样时期内，龙小豆4号的T2和T1之间差异不大，经过方差分析可知各取样时期内不同处理间CAT活性没有显著性差异。天津红经低温处理后，第1天到第4天取样时，CAT活性均为T5>T4，分别高出20.43%、18.18%、13.79%和1.08%，且前2天的差异达显著水平。说明不同抗性品种对低温的应激存在差异，短时低温对抗性较弱的天津红CAT活性影响更为明显。喷施S3307能进一步提高低温条件下CAT活性，对于龙小豆4号而言，CAT活性提高不明显，处理间CAT活性均未达到显著水平；对天津红来说，第1天取样时，T6显著高于T5和T4，其他取样时期T6和T5之间差异不显著。

图5 低温胁迫及喷施S3307对小豆幼苗叶片CAT活性的影响

3 结论与讨论

自然界中植物生长发育不可避免地受到低温、干旱等逆境因素的影响，其中温度是影响植物生长发育，甚至导致植物死亡的最关键环境因子。低温对植物形态结构和代谢活动都有明显的影响甚至伤害，使植物在逆境下产生复杂的生物化学和生理学上的响应[13]。低温胁迫可引起细胞内部的ROS类物质、膜脂过氧化产物、酶功能等发生生理改变[14]。

H2O2是植物体内一类重要的ROS物质，正常条件下H2O2的产生和清除过程基本保持一种精细的平衡状态，这样既保证了植物体内H2O2具有一定的生理功能，同时也将其对植物的伤害效应降到最低。如果打破H2O2产生和清除的这种平衡，就会出现H2O2的积累。由于它具有较高的氧化还原活性，所以能引起细胞内大分子氧化损伤，最终抑制植物体内多种生理生化反应，影响植物体内的调控和代谢[15]。MDA是细胞膜过氧化的产物，能够抑制细胞保护酶活性，从而加剧膜脂过氧化，同时其本身也是具有细胞毒性的物质，其含量的高低可作为质膜受损的重要指标，胁迫强度越大，MDA含量越多，MDA含量与植物耐寒性间呈负相关[7]。张腾国等[16]指出油菜受到低温胁迫后体内H2O2含量迅速增加，邓化冰等[17]指出低温胁迫导致水稻叶片H2O2和MDA含量迅速上升，膜透性增大，损伤细胞生理功能，张爱冬等[4]在对丝瓜的研究中也有相似的报道。本研究结果也表明低温诱导小豆叶片体内H2O2和MDA含量显著增加，但随着温度恢复时间的延长，H2O2含量逐步下降并与对照趋平，这是小豆体内的保护机制的生理作用，尤其是抗氧化酶活性的提高，起到很强的清除H2O2的作用，并抑制ROS自由基与脂质作用发生过氧化反应，最终抑制MDA的产生，有效降低MDA含量。

植物抵御外界胁迫能力的强弱与抗氧化系统水平的高低具有相关性[13]，抗氧化酶是指植物体内存在的一系列可以防止自由基对植物造成毒害的具有清除活性氧自由基功能的酶，如保护酶系统主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等。植物通过SOD、POD和CAT三者协同作用，使体内的氧自由基维持在较低水平，可以在一定程度上减缓或防御低温胁迫[18]。SOD的主要作用是清除超氧根阴离子(O2·-)，但同时产生H2O2，而POD和CAT通过酶促作用降解多余的H2O2等ROS，避免植物遭受因胁迫引起的过氧化伤害。相关研究指出低温可导致植物体内SOD、POD和CAT活性先升高后下降，短时期内可清除多余的ROS，但随着低温胁迫时间的延长，这种保护机能逐渐下降甚至崩溃[7]，这与李春燕等[19]的报道相似，其指出低温处理一段时间后保护酶活性表现出持续下降的趋势，并表明这种持续下降的现象是低温对作物造成了不可恢复的伤害。本研究结果也表明低温胁迫下小豆叶片的SOD和POD活性显著提高，消除ROS的过氧化反应，消除或缓解低温的胁迫效应。

植物生长调节剂预处理是缓解植物非生物胁迫重要措施，S3307是一种有效的植物生长延缓剂，能够显著提高逆境胁迫下作物的抗性生理并有效缓解产量因子受到胁迫，促使作物产量有效提高。Zhao等[10]指出开花期低温条件下，S3307能降低ROS产生速率及MDA含量，并促进保护酶活性提高；杨文钰等[20]指出S3307能减少膜脂过氧化物MDA含量，提高SOD、POD和CAT活性，并增加植物幼苗体内游离脯氨酸的含量；Xiang等[21]指出低温胁迫下S3307能相应提高SOD、POD和CAT活性，增强作物的抗冷性，缓解胁迫并提高产量。本试验结果表明，喷施S3307能缓解低温胁迫对小豆造成的伤害，与喷施清水相比，能够显著降低H2O2和MDA含量、提高SOD和POD活性，增加小豆幼苗的抗冷性。

幼苗期短时低温引起小豆叶片H2O2和MDA含量提高，SOD和POD活性提高，预喷施S3307具有提高小豆幼苗缓解低温胁迫的作用，能显著降低H2O2和MDA含量，显著提高SOD和POD活性。不同品种小豆的生理应激存在显著差异，抗性较弱的品种天津红对低温应激反应更为剧烈；喷施S3307能够有效缓解低温胁迫对小豆的伤害，对天津红的缓解效应更加明显，增加其抗冷性。