自养微生物反硝化法去除沼气中H 2S工艺研究

董晓莹，朱 军，李冰璇，张艳丽，刘昊喆

（1.大连理工大学 盘锦产业技术研究院，辽宁 盘锦 124000；2.阿斯创钛业（营口）有限公司，辽宁 营口115003；3.辽宁省能源研究所有限公司，辽宁 营口 115003）

0 引言

国家环保标准规定，沼气中的H2S浓度一般不超过20 mg/m3，如果不对H2S进行处理而直接利用沼气，将会污染周边环境，对人类健康造成极大威胁，同时腐蚀设备而缩短其使用寿命[1]～[3]。因此，开发适用于去除沼气中H2S的技术是十分必要的。

生物脱硫具有许多传统干法和湿法脱硫所不具备的优势，如条件易控制、能耗和成本低等。自养微生物反硝化脱硫是以硫化物等无机物充当电子供体，通过氧化无机物质来提供合成细胞所需的能量，并将硝酸盐作为电子受体完成降解的过程，因为整个过程不需要额外的碳源，所以极大地节约了脱硫成本[4]，[5]。黄聪[6]通过研究发现，单质硫的回收率受到功能微生物丰度和活性的影响。Ramita Khanongnuch[7]研究了缺氧型生物滴滤塔对H2S的脱除效果，并探讨了3种瞬时条件（液体流量、H2S负荷率和干/湿间歇操作）对生化脱除反应的影响。Eleni Vaiopoulou[8]开发了炼油废水生物法脱H2S工艺，该工艺以硝酸盐为终端电子受体，可将H2S氧化成硫酸盐。但上述研究均未实现产业化应用，为进一步提高脱硫效果，开发高效、低成本的生物脱硫工艺迫在眉睫。

本研究拟考察在缺氧条件下，硝酸盐（代替氧气充当电子受体）对硫化氢的去除效果，从而通过微生物反硝化作用实现氮硫同步脱除的目标。同时，采用响应曲面法对实验值和响应值进行拟合，绘制各因素相互响应曲面，对单因素进行直观分析，从而优化微生物反硝化脱硫的条件，为建立高效的天然气生物净化工艺，并形成具有自主知识产权的生物脱硫成套技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 培养基的制备

无机盐液体培养基（驯化液）的制备：分别称 量NaHCO3，MgCl2和KH2PO4各1 g，0.24 g（NH4）2SO4，1 mL微量元素液，适量的NaNO3和Na2S·9H2O（分别充当氮源和硫源），用蒸馏水充分溶解，再用容量瓶定容至1 L。

微量元素液的制备：分别称量50 g Na2-EDTA，11 g NaOH，11 g CaCl2·2H2O，3.58 g FeCl2·4H2O，2.5 g MnCl2·2H2O，1.06 g ZnCl2，0.5 g CoCl2·6H2O，0.5 g NH4Mo7O24·4H2O和0.14 g CuCl2·2H2O，用蒸馏水充分溶解，再用容量瓶定容至1 L。

固体培养基的制备：在液体培养基的基础上加入适量琼脂。

所有培养基均须在高压灭菌锅内121℃下灭菌30 min后备用。

1.2 反硝化脱硫菌种的筛选

取营口污水处理厂二沉池的泥水混合物进行静置沉淀，取上清液进行稀释，然后加入驯化液中，不断提高驯化液的S2-浓度以对功能微生物进行阶段性驯化，驯化2周后进行固体平板倍比稀释，观察平板上是否有单菌斑的生成。使用接种环将生成的单菌斑接种到含S2-的驯化液中进行扩培，反复进行固液交替纯化，直至观察到固体平板上有外观一致的单菌斑的生成为止，将筛选到的菌株命名为D-12。经过16S rDNA序列分析鉴定，菌株D-12为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌，菌落的形态生理特征为乳白色不透明、椭球状、菌落平坦、边缘整齐。

1.3 微生物反硝化脱硫试验设计

根据沼气中的H2S含量，利用营养液对沼气中的H2S吸收处理后，再通过微生物反硝化脱硫作用对S2-进行去除。影响S2-去除的各因素（S2-浓度，NO3-1浓度和微生物添加量）的水平和编码如表1所示。根据各因素的水平，采用Box-Behnken软件设计了17组试验。

表1 各因素的水平和编码Table 1 The levels and coding of each factor

1.4 微生物反硝化脱硫试验启动

用接种环挑单菌斑，接入含有驯化液的三角瓶中，对脱硫反硝化菌进行振荡培养（试验温度为35℃，振荡速度为150 r/min）1～2周，待驯化液混浊后分别将菌悬液装入无菌离心管，采用离心机（5 000 r/min）离心20 min后去掉上清液，称量菌重，之后投入生物滴滤塔滤料中进行挂膜，显微镜观察挂膜成功后用于反硝化脱硫反应。

脱硫反硝化菌的脱硫工艺流程如图1所示。气体转子流量计控制H2S气体缓慢加入营养液（NaOH+驯化液）中进行化学吸收，之后循环泵和液体转子流量计控制吸收H2S的营养液循环到生物滴滤塔塔顶，通过喷淋器将营养液均匀喷洒在生物滤料上，以进行反硝化生物脱硫反应。滴滤塔夹层设置循环水浴（35℃），保证微生物菌体的生长繁殖不受温度波动的影响。

图1 脱硫反硝化菌的脱硫工艺流程Fig.1 The Desulfurization process flow of desulfurization and denitrification bacteria

1.5 分析方法

采用碘量法测定S2-浓度；采用酚二磺酸比色法测定NO3-浓度；采用pHs25型pH计测定pH值；采用尤尼柯7200型分光光度计测定微生物生长量。

2 结果分析

按响应曲面法优化设计的17组微生物反硝化脱硫试验的试验结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计和结果Table 2 Experimental matrix and results for Box-Behnken design

续表2

2.1 NO3-浓度和微生物添加量的影响

从表2可以看出：当S2-浓度为1 750 mg/L，微生物添加量为225 mg/L，NO3-浓度为0时，S2-去除率为32.13%；当其他条件不变，NO3-浓度升高到为1 000 mg/L时，S2-去除率为98.45%。由此可见，NO3-能够促进S2-的去除，当氧气供应不足时，硝酸盐可以替代氧气作为电子受体，完成生物环境体系中的生化呼吸反应。电子受体有效性是考察还原态硫化物能否被氧化成硫酸盐或者硫单质的关键。有研究表明：当硝酸盐和硫化物的比例为1.17时，硫化物被氧化为硫酸盐；当两者比例为0.29时，硫化物被氧化为单质硫；另外，会有一部分硫化物（10%～11%）在水中溶解氧的作用下发生自氧化[9]。由表2可知，硝酸盐可以在硫化物氧化反应过程中作为一种有效的电子受体。

当S2-浓度为1 000 mg/L，NO3-浓度为500 mg/L，微生物添加量为75 mg/L时，S2-去除率为82.09%；当其他条件不变，微生物添加量增加到225 mg/L时，S2-去除率为97.36%。由此可见，反应体系中微生物添加量的增加有效提高了S2-的去除率。利用功能微生物的代谢作用可以同步去除S2-和NO3-/NO2-，这是因为当微生物添加量增多时，所需要的底物也随之增多，反硝化反应的发生也会强化S2-的去除。有研究表明，当反硝化脱硫体系处于碱性条件下或加入沸石时，可将NO3-的去除率提高到95%以上[10]。

2.2 生物降解模型的建立

在菌株D-12反硝化脱硫过程中，采用Box-Behnken设计法对S2-浓度、NO3-浓度和微生物添加量3个因素进行组合优化，得到二次多项式回归方程预测模型为

Y=92.57-0.011A+33.18B+9.15C-2.46AB+0.18AC+0.35BC+0.79A2-33.07B2-4.68C2

式中：Y为S2-去除率预测值。

表3为预测模型的方差分析结果。由表3可知，试验结果与预测模型非常吻合，A，B，C及各交互因素BC，A2，B2，C2对S2-去除率影响显著，说明该模型能够很好地预测筛选菌株和NO3-协同降解S2-的效果。

模型方程的F值约为351.51，Prob＞F小于0.000 1，即表明该模型是显著的。模型失拟项的Prob＞F为0.278 5，表明该模型的失拟项并不显著，说明模型预测拟合效果良好，无失拟因素的干扰，可以用该模型计算得到的预测值来代替实际值进行响应曲面的分析。决定系数R2和校正系数R2adj分别为0.978 0和0.995 0，即该模型的决定系数和校正决定系数不但较高，而且也较为接近，表明该方程拟合程度很好，拟合的响应值和实际值更为一致。

2.3 响应曲面分析

影响S2-去除率的各因素及其相互作用如图2所示。由图2（a）可以看出，体系中的微生物添加量越高，越有利于S2-的去除。这是因为微生物添加量越高，微生物分泌的功能酶就越多，所需代谢消耗的底物随之增多，从而促进了S2-的去除。微生物的正常繁殖代谢是生物滤池高效脱硫反应的关键因素。当体系中的S2-浓度为1 000～2 500 mg/L，NO3-浓度为0～1 000 mg/L，微生物添加量为75～225 mg/L时，经过38 d的生物去除，体系中的S2-含量均有所降低，并且当S2-浓度为1 750 mg/L，NO3-浓度为1 000 mg/L，微生物添加量为225 mg/L时，S2-的去除率达到最大值99.45%。由图2（c）可以看出，NO3-的添加有利于脱硫反应的进行，这是因为在缺氧条件下，NO3-可以代替氧气作为电子受体，完成生物环境体系中的生化呼吸反应。作为电子受体，NO3-浓度的提高可有效促进S2-的降解，但有报道称当NO3-的浓度超过1 500 mg/L时，会对环境中的微生物菌体造成毒害作用。综上可知，当微生物添加量为150～225 mg/L，NO3-浓度为500～1 000 mg/L时，反应体系中的S2-达到了很好的去除效果。

2.4 预测模型的验证

为验证最优试验条件的准确度，在所求的最优试验参数下进行3组验证试验，并将实际的S2-去除率与预测值相比较，具体结果列于表4。由表4可知，S2-去除率的平均值为98.38%，与预测值100%的相对误差为1.62%，证明该计算模型预测效果良好。

3 结论

试验筛选出的D-12菌株经过16SrDNA序列分析鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），形态为椭球状，经革兰氏鉴定为革兰氏阴性菌。经过38 d的试验考察，D-12菌株在两阶段沼气净化中表现出了较好的同步反硝化脱硫能力。通过Box-Behnken软件预测，当S2-浓度为1 258.61 mg/L，NO3-浓度为843.96 mg/L，微生物添加量为219.96 mg/L时，S2-的预测去除率为100%，实测去除率为98.38%，相对误差仅为1.62%。这表明响应曲面法可简单高效地优化自养反硝化脱硫实验条件。此外，在静态实验中发现，功能微生物破壁后的无细胞提取液具有更高的S2-降解能力，并发现了较多的单质硫，今后可在固定化酶制剂方面做进一步的研究，以获得更稳定、高效的S2-去除效果。