基于铂、钯负载的MoS2纳米片构建生物传感器及应用

周丽亚，周栖桐，赵聪俐，姜艳军，马丽，贺莹

（1河北工业大学化工学院，天津 300130；2天津中医药大学健康科学与工程学院，天津 301617）

自单原子层石墨烯发现后，以其为代表的二维纳米材料得到了深入的研究，除石墨烯外，其他的二维材料，尤其是过渡态金属硫化物，特别是二硫化钼（MoS2），由于价格低、化学性质稳定、良好的电催化活性等优异性能引起了研究工作者极大的兴趣[1-4]。MoS2本身的导电率较低，二维的片层结构之间主要依赖范德华力隔开的S—Mo—S键紧密堆叠而成，在循环使用的过程中易发生团聚，抑制了电子的传递能力，降低了导电能力[5-6]。为了解决上述问题，扩大MoS2的使用范围，已经有研究通过各种方法改善MoS2的性能，如Yousaf等[7]采用水热法利用乙二醇为还原剂在MoS2纳米片上负载了Co和Ni的纳米颗粒，由于Co和Ni之间的协同作用提高了电催化活性，降低了电子传递的阻碍，在析氢电催化反应中体现出催化性能要优于商品化的Pt/C催化剂。Wang等[8]利用水热法和溶剂法连续反应制备了海胆状的CoS/MoS2纳米球，CoS纳米颗粒生长在MoS2纳米片层的表面，纳米片自组装成球形纳米颗粒，制备的纳米复合物有丰富的活性位点和高的导电性。但将MoS2复合材料应用于生物传感器领域要求电极表面的纳米材料具有尽可能高的比表面积。因此，如何在有限的电极表面尽可能多地提高纳米材料的表面积、提高电子转移能力，是发挥二维纳米材料优异性能的关键。铂和钯同属于铂族元素，具有良好的生物兼容性和电催化性能，因此将金属Pt、Pd修饰在MoS2上，利用MoS2中的硫原子使Pt、Pd在分子层中共价结合，通过沿z轴的范德华力作用堆叠在一起，可以改变MoS2的能带结构、增加导电性能、提高生物相容性，从而拓展MoS2在传感、储能等多领域的应用。

当前国家大力提倡餐桌上的安全和环境保护，有机磷农药（OPs）作为常用的一类杀虫剂在控制农作物病虫害和农业增产增收方面发挥着重要作用，但是过度使用OPs而引起的农药残留问题已经成为影响环境和食品安全的重大隐患。生物传感器法检测OPs由于具有响应快、操作简便、微型化和可现场检测等优点成为当今研究的热点[9]。本文首先将块状二硫化钼剥离成片层状二硫化钼纳米片，并将Pt和Pd金属纳米颗粒负载于二硫化钼纳米片上，通过SEM、TEM、XRD和XPS等材料学表征手段考察其结构和组成，并将该纳米复合物修饰玻碳电极制备乙酰胆碱酯酶生物传感器，考察其对OPs的检测性能。

1 试验材料和方法

1.1 试验试剂

乙酰胆碱酯酶（AChE，EC3.1.1.7）、马拉硫磷、甲基对硫磷和pluronic F127购买于Sigma；二硫化钼（MoS2）、抗坏血酸、氯化硫代乙酰胆碱（ATCl）、四氯钯酸钠（Na2PdCl4）、氯亚铂酸钾（K2PtCl4）、氯铂酸（H2PtCl6）、铁氰化钾［K3Fe(CN)6］、Pt/C、壳聚糖等购自上海阿拉丁公司。

1.2 试验仪器

电化学工作站（CHI650E），上海辰华仪器有限公司；高速控温离心机（3K18），Sigma公司；扫描电子显微镜（JSM-6700F），日本JEOL公司；透射电子显微镜（2100f），日本JEOL公司；X射线光电子能谱（Escalab 250Xi），上海辰华仪器有限公司；数控超声波清洗器（KQ2200DB），昆山市超声仪器有限公司。

1.3 纳米复合物的制备方法

1.3.1 Pt-Pd/MoS2的制备

首先将块状二硫化钼剥离成层状，取MoS260mg，加入乙醇和水（体积比9∶11）共10mL，将混合物置于超声振荡器中，50Hz超声8h后，在离心机中3000r/min离心20min，取上清液，置于高速离心机中10000r/min离心10min，取沉淀物，真空冷冻干燥后备用。

将F127（10mg）充分溶解于0.7mL H2PtCl6（10mmol/L）、0.7mL K2PtCl4（10mmol/L）和0.7mL Na2PdCl4（10mmol/L）的混合溶液中，加入1mg的剥离后的MoS2混合均匀后，加入1.0mL 30mmol/L的抗坏血酸溶液，然后在超声波50Hz、40℃下反应6h。反应结束后，用水和乙醇离心洗涤（14000r/min、10min）各3次去除模板F127，干燥后得到MoS2表面负载Pt和Pd纳米颗粒的纳米复合物（Pt-Pd/MoS2）。

1.3.2 介孔铂钯双金属纳米花的制备过程

利用Yamauchi课题组[10]的改进方法，具体步骤如下：将F127（60mg）充分溶解于1.2mL H2PtCl6（20mmol/L）、1.8mL K2PtCl4（20mmol/L）和0.6mL Na2PdCl4（20mmol/L）的混合溶液中，加入60μL的盐酸溶液（6.0mol/L）混合均匀后，加入3.0mL 0.1mol/L的抗坏血酸溶液，然后在超声波50Hz、40℃反应4h。反应结束后，用水和乙醇离心洗涤（14000r/min，10min）各3次去除模板F127，干燥后得到产物介孔铂钯双金属纳米花（MPtPdN）。

1.4 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE传感器的制备

玻碳电极首先用0.05μm和0.3μm的抛光粉在麂皮上进行打磨，然后依次在硝酸溶液（0.1mol/L）、乙醇和超纯水中超声清洗，直至玻碳电极的表面呈光滑的镜面。将Pt-Pd/MoS2（0.75μg）加入到1.0mL 0.2%的壳聚糖溶液中，超声至形成均一的悬浊液。取6.0μL壳聚糖和Pt-Pd/MoS2复合物悬滴到处理好的玻碳电极上，室温下自然干燥，得到Pt-Pd/MoS2/GCE电极，然后将6.0μL AChE溶液悬滴到Pt-Pd/MoS2/GCE电极上，室温下自然干燥，然后用pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗掉多余的AChE，干燥后即得到AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE电极。电极置于4℃冰箱中待用。作为对比MoS2/GCE、Pt/C/GCE和MPtPdN/GCE电极同样按照类似的方法制备。

1.5 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE传感器的电化学测量

采用三电极体系，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，修饰的玻碳电极为工作电极。在室温条件下，利用循环伏安法（CV）和交流阻抗法（EIS）考察修饰电极的过程对响应电流的影响；通过时间电流法考察电极的响应性和酶对底物的亲和能力；差分脉冲伏安法（DPV）测定OPs检测的标准曲线。

1.5.1 电活性表面积的计算

通过Randles-Sevcik方程［式(1)］计算电活性表面积。

式中，n为参与反应的电子数；Ip为氧化峰电流值，μA；C为K3Fe(CN)6的浓度，mol/cm3；D为K3Fe(CN)6在溶液中的扩散系数，D=0.63×10-5cm2/s（20℃）；v为扫描速度，V/s；A为电极的电活性表面积。

1.5.2 动力学参数的计算

表观米氏常数（Km）是衡量酶和底物亲和能力的重要参数，反映生物传感器电极表面生物酶的动力学特征。利用时间电流法，固定工作电压为0.65V，在持续搅拌下每隔一段时间向PBS溶液中加入一定量不同浓度的ATCl溶液，得到时间-电流曲线（i-t曲线）。Km值可以通过Lineweaver-Burk方程［式(2)］进行计算。

式中，Is为加入ATCl后的电极的初始响应电流；C'为ATCl的浓度；Imax为电极的最大响应电流。通过分析Is与ATCl浓度的倒数关系[式(2)的斜率和截距]，可计算得到Km值。

1.5.3 农药抑制率的测定及计算方法

在含有ATCl的PBS溶液中利用差分脉冲伏安法（DPV）测量AChE/CS-MPtPdN/GCE电极在OPs抑制前后在0.65V电压下的响应电流峰值（抑制前后的响应电流峰值记为I0和I1），由式(3)可以计算得到响应的抑制率。

1.6 实际样品的处理方法

市场上购买的卷心菜和黄瓜清洗干净后，沥干水分。取2g蔬菜样品喷洒上2mL不同浓度的OPs，置于4℃冰箱中保存24h。再将混合物研磨成浆，加入10mL PBS（0.1mol/L，pH=8.5）超声混匀，离心后将上清液转移到100mL的容量瓶中，并用PBS溶液稀释到刻度；取20mL上述溶液进行DPV测试。

2 结果与讨论

2.1 层状MoS2和Pt-Pd/MoS2的表征

Pt-Pd/MoS2的制备过程如图1所示。图2和图3分别为剥离后的层状MoS2和Pt-Pd/MoS2的扫描电镜和透射电镜照片，从图2(a)和图3(a)可以看出剥离后的MoS2呈现出层状，且其边缘有清晰的边界，由图2(b)和图3(b)可以明显看到在MoS2的表面上有大量纳米颗粒附着，纳米颗粒在片层表面分布均匀，基本没有出现团聚现象。图3(c)是Pt-Pd/MoS2的高倍透射电镜照片，纳米颗粒的尺寸在2～5nm，通过对晶格间距的分析，可知晶间条纹为0.274nm和0.625nm对应MoS2的(100)和(002)晶面[11]。晶间条纹为0.222nm和0.234nm对应Pt(111)和Pd(002)的晶面[12]。这说明Pt和Pd的纳米颗粒成功修饰在MoS2的表面。通过面扫元素分析图［图3(d)］说明Pt-Pd/MoS2中S、Mo、Pt、Pd元素同时存在，也证明了Pt和Pd已经成功负载在MoS2纳米片上。

图1 Pt-Pd/MoS2的制备过程

图2 剥离后的层状MoS2和Pt-Pd/MoS2的扫描电镜图

图3 剥离后的层状MoS2和Pt-Pd/MoS2的透射电镜图

通过XPS表征方法考察MoS2和Pt-Pd/MoS2的化学组成和元素价态。图4(a)为MoS2和Pt-Pd/MoS2的全波长谱图，与MoS2的谱图相比，除了都存在Mo、S、O、N、C元素外，在Pt-Pd/MoS2上有明显的Pt和Pd的特征峰。图4(b)是Mo 3d的高分辨谱，位于229.5eV和232.5eV处的峰是Mo的3d3/2和3d5/2自旋轨道，归属于MoS2中Mo4+，226.5eV处的峰是MoS2中S2-的2s轨道的特征峰[13-14]，236.0eV处的峰归属于Mo6+的3d3/2轨道，这可能是由于MoS2的表面有部分被氧化成为MoO3[12]；图4(c)是Pd 3d的高分辨谱，335.1eV和341.5eV处的峰分别归属于Pd0的3d5/2和Pd2+的3d3/2轨道；图4(d)是Pt 4f的高分辨谱，72.7eV和76.1eV处的峰归属于Pt 4f7/2和Pt 4f5/2自旋轨道[15]，说明在制备的材料中存在Pt金属纳米颗粒；图4(e)是S 2p的高分辨谱，161.7eV和163.1eV处的峰分别归属于S2-的2p1/2和2p3/2的特征峰[16]。

图4 MoS2和Pt-Pd/MoS2的XPS图谱

2.2 制备电极的电化学性能

图5(a)为空白电极、Pt-Pd/MoS2/GCE、Pt/C/GCE、MPtPdN/GCE和MoS2/GCE在含有5.0mmol/L K3Fe(CN)6和0.1mol/L KCl的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）溶液中的循环伏安图，由图可以看出，绿色线条对应Pt-Pd/MoS2/GCE电极的扫描结果具有最大的氧化还原峰，略高于商品化的Pt/C制备的电极，同时远远高于MPtPdN/GCE和Pt/C/GCE，说明制备的Pt-Pd/MoS2纳米复合物在降低贵金属用量的同时达到更好的电化学性能。图5(b)为空白电极、Pt-Pd/MoS2/GCE、Pt/C/GCE、MPtPdN/GCE和MoS2/GCE的交流阻抗图，Pt-Pd/MoS2/GCE在低频区的半圆直径最小，明显低于MoS2/GCE，说明Pt-Pd/MoS2/GCE与其他电极相比具有较小的阻抗，这主要是因为Pt和Pd本身就是良好的电子传递介体，其次Pt和Pd调节了二硫化钼纳米片的能带结构，使其电导性能提高。通过Randles-Sevcik公式计算Pt-Pd/MoS2/GCE电极的电活性表面积为0.2917cm2。

图5(c)是空白电极、Pt-Pd/MoS2/GCE、MoS2/GCE、AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE和AChE/MoS2/GCE在含有1.0mmol/L ATCl的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）中的循环伏安图。由图5(c)可以看到，只有AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE和AChE/MoS2/GCE两支电极在0.65V附近出现明显的不可逆氧化峰，而其他的电极都没有氧化峰出现，同时AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE（绿色）比AChE/MoS2/GCE（紫色）的峰电流值更高，也进一步印证了Pt-Pd/MoS2具有优异的电化学性能。图5(d)为AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在50～150mV/s的扫描速度下的循环伏安图，由扫描速度和氧化峰电流值的拟合曲线可知，扫描速度在50～150mV/s范围，扫描速度与氧化峰电流值呈线性关系，拟合方程为y=0.01227x+3.165（R2=0.9960），相较于扫描速度的平方根与氧化峰电流值的关系，具有更好的拟合效果，因此可说明在AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE电极表面发生的反应属于表面控制。

图5 制备电极的电化学性能

2.3 试验条件的优化

2.3.1 pH对生物传感器响应的影响

由于反应体系的pH对AChE充分发挥催化活性具有显著的影响，因此考察不同的pH（6.5～8.5）对氧化峰电流的影响。如图6(a)所示，在pH为7.5时具有最大的氧化峰电流值，这与AChE的最适pH一致，因此后续试验选择pH为7.5。

天上繁星历历，星光在宇宙中旅行千百亿年，将能量汇聚在一起，又分散开来，分分合合之间，无数的时空生生灭灭，连光都逃不出的宇宙，它的边界在哪里？由星空往下，在茫茫寰宇中，大唐像一片树叶？长安像树叶之中的一个斑点？万花谷？针尖一般的美梦。现在夜露下降，凝结在万花谷的草木之上，滋养生息，任其枯荣成败。由三星望月到云锦台，由一间小刹到仙迹岩，由揽星潭到天工坊，由水月宫到千机阁，由聋哑村到更远的绝情谷，桃源的灯火一盏一盏地灭掉。再平常不过的夏天的夜晚，习习凉风，吹起夏虫鸣，草木香，催发人世好梦。

2.3.2 酶负载量对生物传感器响应的影响

酶的负载量也是影响电极性能的主要因素，考察了不同的AChE负载量对氧化峰电流的影响。如图6(b)所示，随着酶修饰量由0.04U增加至0.06U，氧化峰电流值也随之增大，但当AChE的量再增大，氧化峰电流值略有降低，这可能是由于过多的AChE会造成酶活性位点的相互遮盖，影响酶的活性，因此后续试验选择酶的负载量为0.06U。

2.3.3 Pt-Pd/MoS2的修饰量对生物传感器响应的影响

考察在电极上修饰不同质量的Pt-Pd/MoS2（0.25～1.25μg）对氧化峰电流值的影响。如图6(c)所示，在Pt-Pd/MoS2的修饰量从0.25μg增大至0.75μg时，氧化峰电流值不断增大，Pt-Pd/MoS2的修饰量再增大，氧化峰电流值不再增大反而略有降低，这是由于Pt-Pd/MoS2具有良好的导电能力，修饰适量的Pt-Pd/MoS2纳米复合物，尤其是纳米材料形成单层膜的情况下，会使传感器达到最大的灵敏度，但Pt-Pd/MoS2的修饰量过大时，会在电极的表面形成不均匀的双层或多层膜，对电子传递产生阻碍。因此后续试验选择Pt-Pd/MoS2的修饰量为0.75μg。

图6 试验条件的优化

2.3.4 农药抑制时间的影响

电极在OPs中的抑制时间是影响抑制率的重要因素，因此，将电极在马拉硫磷的溶液中抑制不同时间，考察其对抑制率的影响。如图6(d)所示，抑制时间为100～400s时，抑制率不断增大，继续增大抑制时间，抑制率无明显的变化，表明此时马拉硫磷与AChE的结合状态已达到饱和[17-19]。后续试验选择400s为抑制时间。

2.4 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在ATCl中的计时电流响应

图7是AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE的时间电流工作曲线。试验条件是在持续磁力搅拌的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）的溶液中，工作电压0.65V下，每隔50s加入不同浓度的ATCl。由图7可知，随着溶液浓度的不断增加，电流值呈阶梯状不断增大，且在5s左右达到稳定，说明AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE对ATCl具有良好的响应性，且ATCl的浓度在100～3200μmol/L范围内与电流大小呈现线性关系，且当ATCl的浓度为3200μmol/L后，响应电流值趋于稳定，这符合典型的米氏过程，根据L-B方程，ATCl浓度与电流值的双倒数作图可以计算得出表观米氏常数［图7(b)］，AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE传感器上AChE的Km为883μmol/L。

图7 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE的时间电流曲线

2.5 马拉硫磷和甲基对硫磷的检测范围

图8 制备电极在不同浓度的马拉硫磷和甲基对硫磷抑制400s后的DPV图

表1 Pt-Pd/MoS2对马拉硫磷的检测性能与相关文献的比较

2.6 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在实际样品中农药回收率的测定

考察AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在卷心菜中的马拉硫磷和甲基对硫磷两种农药的回收率，见表2所示。AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE传感器对于卷心菜中的有机磷农药的检测回收率为91.4%～103%，相对标准偏差为1.9%～4.5%。研究结果表明该生物传感器具有较好的回收率和准确性，可用于实际样品的分析。

表2 实际样品中OPs的回收试验（n=3）

2.7 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE的选择性

图9 不同干扰物对测定马拉硫磷氧化峰电流值的影响

2.8 储藏稳定性和重现性

将制备好的电极储藏在4℃的干燥环境中，每隔一段时间测量在含有1mmol/L ATCl的0.1mol/L PBS（pH 7.5）中的DPV曲线。试验结果表明，储藏38天后仍能保持90%以上的初始响应电流值，显示了良好的储藏稳定性，电流值在长时间储藏后有一定程度的降低，可能是储藏过程中酶活力降低导致的。

用同样的制备方法制备6支电极，分别测量在1×10-10mol/L的马拉硫磷溶液中抑制10min后，在含有1mmol/L ATCl的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）中的DPV曲线，相对标准偏差为4.69%；并对同一支电极在1×10-10mol/L的马拉硫磷有机农药抑制10min后，在1mmol/L的ATCl中重复测定8次的DPV曲线，相对标准偏差为4.58%，表明AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE具有良好的重现性。

3 结论

利用Pt-Pd/MoS2在玻碳电极表面固定AChE，制备了AChE生物传感器，当酶负载量为0.06U、Pt-Pd/MoS2的修饰量为0.75μg、缓冲溶液pH为7.5时，生物传感器具有较好的响应性。测定动力学参数Km为883μmol/L；并以马拉硫磷和甲基对硫磷为代表，研究了制备电极的检测性能，马拉硫磷的检测 范 围 为1×10-14～1×10-5mol/L，检 测 限 为4.69×10-14mol/L；甲基对硫磷的检测范围为1×10-15～1×10-5mol/L，检测限为5.23×10-15mol/L（S/N=3）。同时电极具有良好的抗干扰性、储藏稳定性和重现性。贵金属纳米颗粒和MoS2纳米片的结合，一方面贵金属纳米颗粒为本来就具有边缘活性的MoS2纳米片材料提供了更丰富的活性位点，同时增大了比表面积；另一方面，MoS2纳米片具有的二维稳定的结构，可以在保证发挥高效的电化学活性的同时降低贵金属的用量，降低生产成本，为二维纳米材料构建高效生物传感器提供了思路，其应用范围可以拓展到传感器制备和电催化等领域。