四川某猪场猪蓝耳病感染情况检测分析

胡 晓，杨 蕊

（1.内江市种猪场，四川 内江 641007；2.西南大学动物科学学院，重庆 荣昌 402460）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）又名猪蓝耳病，是20世纪80年代出现的一种新型高致病性传染病。该病在1987年最早发现于美国。2007年1月我国将其列为一类动物疫病［1］。猪蓝耳病在各个猪场之间广泛传播，有的猪场使用疫苗，而有的未使用，但均有一些猪场发病，主要引起繁殖母猪生产性能严重下降和仔猪的呼吸道症状，生长发育不良，甚至继发细菌性传染病，如副猪、传胸等，给猪场造成了严重的经济损失。本试验以四川某猪场未进行蓝耳病疫苗免疫的3～4月龄架子猪为研究对象，采集血液样本235 份分离血清，用间接ELISA 法检测猪蓝耳病抗体，同时根据猪蓝耳病病毒ORF6 基因设计引物，采集19 份血液样本进行RT-PCR检测。现将检测结果报告如下：

1 试验材料

1.1 被检血清及血液样本的采集 血清样本采集：随机选择四川某猪场未进行蓝耳病疫苗免疫的3～4月龄架子猪，前腔静脉采血2～5 mL，共采集235 份，放入离心管中，室温下静置2～4 h，待血液凝固血清析出后，以3 000 r/min 离心分离血清，于-20 ℃保存待检。

血液样本采集：使用医用真空抗凝采血管，随机采集未免疫的架子猪前腔静脉血液2～5 mL，共采集19份，置4～8 ℃保存待检。

1.2 试剂 猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，山东绿都生物科技有限公司生产（批号：2018010136）；RNA基因组提取试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司生产（批号：20170503202）。

2 方法

2.1 猪血清蓝耳病ELISA抗体检测

2.1.1 样品准备 将保存的待测血清取出，室温静置30 min，用试剂盒样品稀释液对血清样品进行40倍稀释，阴、阳性对照进行4倍稀释。

2.1.2 试剂准备 将10×浓缩洗涤液在使用前恢复至室温，有沉淀的等到其沉淀溶解，然后用蒸馏水进行10 倍稀释（即10 μL 浓缩洗涤液加入90 μL的蒸馏水）。

2.1.3 操作步骤 将试剂盒取出，待其恢复至室温。取出抗原包被板，根据样品数拆分出需要的孔数，并对样品位置进行标记和记录，在相应孔的位置上加入稀释好的样品100 μL。各取100 μL 阴、阳性对照加入到抗原包被板中，每次检测各设两孔对照。加样完成后，37℃孵育30min。将各孔的废液弃去，每孔加入稀释好的洗涤液200 μL洗板，重复此操作5次，每次2～3 min。倒掉洗涤液后将孔中残留的液体拍干，每孔加入酶标二抗100 μL，37 ℃孵育30 min。再将孔中液体弃去，加入洗涤液洗板，重复5 次，拍干，每孔加入100 μL TMB 底物液。37 ℃孵育15 min 后，用移液枪在板条上每孔加50 μL 的终止液，立刻于450 nm波长处用酶标仪测定各孔的吸光值。

2.1.4 结果判断（按试剂盒说明书进行）猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的阴阳性需通过计算每个样品的S/P值来判断。

计算方法：样本S/P 值＝（样本OD 值－阴性值的平均值）/（阳性值的平均值－阴性值的平均值）。

若样品S/P 值≥0.25，则判定为抗体阳性；若样品S/P值≤0.20，则判定为抗体阴性；若0.20≤样品S/P值≤0.25，则判定为可疑。

2.2 蓝耳病RT-PCR检测

2.2.1 蓝耳病病毒ORF6 基因引物合成 根据已知的ORF6 基因引物序列，送上海生工生物公司合成（见表1）。

表1 ORF6基因引物

2.2.2 猪蓝耳病病毒RNA 的提取 将保存的待测液取出加入100～200 μL 氯仿，用力摇匀。将加好氯仿的血液样品以12 000 r/min 冷冻离心15 min，吸取上清液移入到新的去RNA 酶离心管中，加入0.25 mL异丙醇，轻柔地翻转几次将其摇匀，在冰盒上静置35 min后以12 000 r/min冷冻离心15 min，弃去上清液取400 μL 用75%的酒精进行三次洗涤，尽量去除离心管内的异丙醇等其他物质。用移液枪把离心管内剩余的液体尽量吸干净，打开离心管盖放冰盒上10 min 待酒精挥发晾干，根据沉淀的多少加入20～40 μL 的去RNA 酶水，悬浮静置片刻待其溶解后保存备用。

2.2.3 猪蓝耳病病毒RNA 的反转录 将上一步获得的RNA作为模板，根据实验室制定的反转录条件配制反转录体系。在PCR仪上进行反转录，经过30 ℃退火反应，42 ℃延伸反应，99 ℃变性反应后获得猪蓝耳病病毒cDNA。反转录体系见表2，反转录条件见表3。

表2 反转录体系

表3 反转录条件

2.2.4 ORF6基因PCR扩增反应体系及条件 将以上反转录产物作为模板，用上、下游引物扩增目的基因片段，再添加Taq DNA酶、dNTP于PCR反应管中，用ddH2O 配平反应体系。然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，发生预变性、变性、退火、延伸、总延伸反应，同时经过30 个循环后，得到PCR产物。反应体系及条件见表4。

表4 PCR反应体系及条件

2.2.5 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳 取0.4 g 琼脂糖加入40 mL 水配制成浓度为1%的凝胶，在微波炉上熔至清澈透明的溶液状。冷却到60 ℃左右，加入EB 染料，摇匀，倒入事先安装好的水平电泳槽内，凝胶厚度一般为3～5 mm，等到凝胶完全凝固后，室温下放置30 min。根据样品量选用梳子，在梳子齿附近加入少量电泳缓冲液，后缓慢轻轻地向上拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，用移液器吸取样品注入孔内。给电泳仪通上电，30 min 后在凝胶成像系统中观察结果。

3 试验结果

3.1 猪血清蓝耳病ELISA 抗体检测结果 对未免疫的235 份血清样品进行ELISA 抗体检测，结果得出阳性149份，阴性52份，可疑34份，阳性率为63.4%。

3.2 猪蓝耳病RT-PCR 扩增结果 利用RTPCR方法对19份血液样本进行蓝耳病病毒检测，结果显示：19 份样本中只有367-8 号样本为阳性，其余18份样本均为阴性，阳性率为5.26%（见表5）。

表5 猪蓝耳病RT-PCR扩增结果

4 讨论

4.1 Albina 等［2］用PRRSV 接种猪肺泡巨噬细胞（PAMs）培养病毒抗原，首次建立了检测PRRSV抗体的酶联免疫吸附试验，其特异性和敏感性高于过氧化物酶单层试验（IPMA）和间接免疫荧光法（IFA）。本试验也采用ELISA 方法对未免疫架子猪的血清进行（PRRSV）抗体检测。结果阳性有149份，阳性率为63.4%。刘琳［3］对中西部部分地区的未免疫规模化猪场进行PRRSV ELISA 抗体检测，得出阳性率为84.46%；郝中香等［4］对四川省某个未免疫规模化猪场的70 份血清进行PRRSV ELISA抗体检测，结果阳性率为90%。本试验对PRRSV的阳性检出率均低于上述报道，说明该场猪蓝耳病感染没有上述报道的严重，但阳性率仍然较高，达到63.40%，应引起猪场的高度重视。

4.2 RT-PCR 法被广泛应用于猪蓝耳病病毒的检测，目前已成为实验室诊断蓝耳病毒的主要手段。其主要优点是特异性强、灵敏度高，不用进行病毒分离鉴定，省时、省力。但是在临床实践中，越来越多的蓝耳病病毒开放阅读框（ORF）出现变异情况，针对不同开放阅读框设计的引物的特异性不强，RT-PCR 诊断结果的差异较大。在整个蓝耳病病毒基因组中，以ORF6 最为保守，可作为分子生物学鉴定的重要依据。因此，本试验选用ORF6 基因设计引物，对采集的血液样本进行RT-PCR 扩增，结果得出阳性率为5.26%。漆信桥［5］对四川省各地送检的100 份血清样本进行蓝耳病毒RT-PCR 检测，得出阳性率为34%；蒋刘柱［6］对四川绵阳地区部分疑似发病猪场的78 份样本进行蓝耳病毒RT-PCR 检测，得出阳性率为35.90%。本试验结果与上述报道相比，阳性检出率较低，其原因可能与检测样本较少，缺乏代表性，或感染时间较长，病毒血症状消失有关。