分散液液微萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶饮料中黄曲霉毒素B1和B2

陈佩佩，陈琳珊，陈 茹

（1.广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司,广东广州 511442；3.广东省质量监督食品检验站,广东广州 511442）

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的一类次生代谢物[1]，从化学结构上，均属于双呋喃香豆素衍生物，是一类毒性极强的双呋喃环类毒素。由于AFT产生菌在自然界中广泛存在，很多的动植物源性食品都有可能存在污染[2]，尤其在植物的种植、加工、运输、储存等过程都有可能被产生菌污染，从而产生毒素[3]。同时，黄曲霉毒素在自然条件下稳定性较强，极性较低，难以用水或紫外线完全除去，只有在强碱性条件下容易分解[4]，过多的摄入引起致癌、致畸和致突变等毒性效应[5]，其中以黄曲霉毒素B1的毒性致癌性最强。近年来，我国黄曲霉毒素污染事件频繁发生，因此，建立高效、通用、灵敏的相关检测方法，对企业生产，消费者安全都有十分重要的意义。

目前，国内外对黄曲霉毒素的检测方法主要有高效液相色谱法[6-7]、液相色谱-串联质谱法[8-9]或液相色谱-高分辨质谱法[10]、免疫学检测法[11-12]。高效液相色谱法操作烦琐，尽管检测器灵敏度高，但杂质多，分析时间较长，免疫学检测法虽然能大批量检测，但易与类似结构的化合物发生反应，出现假阳性，结果偏差较大。质谱法应用较广，前处理简单，定性定量能力好，但高分辨质谱价格昂贵，难以广泛应用。本文以分散液液微萃取为前处理手段，建立了液相色谱-串联质谱法对茶饮料中的黄曲霉毒素B1和B2进行测定。方法学验证结果表明，方法整体方便快捷，灵敏度高，回收率好，可日常大批量检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

API4000Q质谱仪、岛津LC-20AD液相色谱系统、4k-15离心机、IKA Vortex4涡旋混匀器、Milli-Q Advantage A10超纯水系统。

1.2 材料与试剂

茶饮料，广州市售；黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2，纯度大于98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸、乙腈、3-氯苯胺、三氯甲烷，均为HPLC级，美国Thermo Fisher公司；盐酸、磷酸钠，均为分析纯，广州试剂厂；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.3 样品前处理

于15 mL尖底离心管中加入1 mL 2 mol/L的盐酸溶液和50 μL 3-氯苯胺充分混匀，然后加入5 mL样品，涡旋提取10 min，使用1 mol/L的磷酸钠溶液调节pH至6，涡旋混匀后置于离心机中以4 500 r/min离心5 min，使3-氯苯胺沉淀。除去上层水相，下层3-氯苯胺用乙腈定容至200 μL，待测定。

1.4 标准曲线的绘制

标准储备溶液：分别准确称取黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2标准品各0.050 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用乙腈稀释成500 mg/L的储备液。

标准中间溶液：用乙腈将上述储备液稀释成浓度为10 mg/L的标准中间液。

溶剂曲线：使用乙腈配制成1.0 µg/L、2.0 µg/L、5.0 µg/L、10 µg/L、20 µg/L、50 µg/L 和 100 µg/L 的标准使用液，绘制校准曲线。

基质曲线：使用空白乌龙茶基质液配制校准曲线，浓度点与溶剂曲线相同。

1.5 色谱及质谱条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Xbridge BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.0 µm）；进样体积：10 µL；流速0.5 mL/min；柱温：35 ℃；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；等度洗脱程序：0.0～5.0 min，75% A。

1.5.2 质谱条件

离子源：ESI源；离子化模式：电喷雾电离源正模式（ESI+）；气帘气压：241 kPa；毛细管电压：5 500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；雾化气压力：345 kPa；加热辅助气压力：345 kPa；碰撞气（CAD）：中等；采集模式：多反应监测（MRM）模式。

2 结果与分析

2.1 定性定量分析依据的收集

根据黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的化学结构，其含有较多含O基团，在离子化过程中倾向于得到质子，因此分别以其相对分子质量加上H+质量，初步确定母离子质荷比。以混合流动相的流动注射的方式向离子源注射标准溶液，在m/z313.1和m/z315.1处，均得到较高响应的[M+H]+离子，同时以多反应监测（MRM）模式采集二级碎片。进一步优化去簇电压DP和碰撞电压CE，得到较优响应，二级质谱图见图1，详细质谱信息见表1。

表1 黄曲霉毒素B1、B2质谱数据

图1 黄曲霉毒素的二级质谱图

2.2 分散剂的选择

分散液液微萃取过程中，加入分散剂和待测样液互溶，加入萃取剂振荡形成微小的液滴，这些液滴在移动的过程中于对目标物进行连续萃取，形成水/分散剂/萃取剂形成均相乳浊液体系，快速完成分析物在水溶液与萃取剂之间的分配平衡。选择盐酸作为分散剂。在本实验中，当分散剂用量小于0.6 mL时，提取回收率低于70%，使用量为1.0 mL时，回收率达到最高，随着使用量提高至1.2 mL，回收率有所回降。所以盐酸分散剂用量选取为1.0 mL。详细结果见图2。

图2 分散剂体积对回收率的影响

2.3 萃取剂体积的选择

在分散剂体积为1 mL的条件下，分别用30 μL、50 μL、70 μL、90 μL、110 μL和130 μL的3-氯苯胺进行萃取，考察了不同体积的萃取剂对萃取回收率的影响，结果如图3所示。随着3-氯苯胺体积增大，回收率也增大，而当体积大于50 μL时，回收率增大不明显，而且3-氯苯胺的使用体积越大，pH回调的幅度也越大，实验更耗时，最终定容液3-氯苯胺的占比也越大，对于含有甲酸的流动相体系，容易造成溶剂效应，使峰型变差。因此，最终确定3-氯苯胺50 μL为最佳萃取体积。

图3 萃取剂体积对回收率的影响

2.4 基质效应的探讨

市售的茶饮料会添加糖、色素、酸度调节剂或其他添加剂，且含量远超于黄曲霉毒素可能存在的含量，加上茶叶本身含有较多的天然物，因此有可能造成较严重的基质效应（ME），使定量结果偏差较大。为了探究实验实际存在的基质效应，分别用空白基质液和乙腈配制了基质曲线和纯溶剂曲线，并以基质曲线和纯溶剂曲线的斜率比ME值为判断依据，当ME在80%～120%时，则说明基质效应不明显。实验结果显示，黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的ME值分别为23.2%和26.5%，说明基质负效应明显，因此最终选择使用基质曲线进行定量，以校正基质效应造成的偏差。

2.5 定量分析结果

使用空白基质溶液配制标准曲线，线性范围为1.0～100 µg/L，将该曲线于优化后的条件下测定，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。同时以信噪比S/N=3和信噪比S/N=10分别确定方法的检测限与定量限。黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2定量离子流图见图4。

图4 黄曲霉毒素提取离子流色谱图

结果表明，黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的相关系数r分别为0.999 6和0.999 3，基质曲线方程分别为Y=5 050X+2 240和Y=3 090X+2 750，检测限均为20.0 ng/kg，定量限均为50.0 ng/kg。由分析结果可知，本方法定量能力好，检出限低，可有效对茶饮料中的黄曲霉毒素进行定量分析。

2.6 回收率及精密度分析

分别对市售的3种茶饮料（绿茶、乌龙茶、红茶）进行测定，结果均为阴性。使用该样品进行加标回收实验。每种样品均按照定量限的1倍、2倍和10倍进行添加，即0.05 μg/kg、0.10 μg/kg、0.50 μg/kg浓度水平，每个浓度水平在日内平均测定6次，平均回收率和相对标准偏差结果见表2。

表2 加标回收率及相对标准偏差数据（n=6）

3种样品的平均回收率范围在71.2%～91.0%，RSD范围在2.23%～6.43%，方法回收率、精密度及准确度良好，可用于实际样品的测定。

3 结论

以液液微萃取为基础，建立前处理方法，方法整体高效简单，通过调节pH，较大限度回收萃取剂，提高了回收率；建立UPLC-MS/MS法，优化了色谱及质谱条件，两种黄曲霉毒素在样3 min内出峰，且峰型良好。使用基质曲线对定量结果进行校准，降低了基质效应对结果的影响。回收率和相对标准偏差数据表明，方法灵敏度高、重现性好，可为茶饮料中毒素测定方法的开发提供依据。