五氟苄基衍生化GC-MS法检测血液中叠氮离子

李茂盛，郑水庆，盛振海，何思阳，邓乾亚，梁晨，吴忠平，曹芳琦，杜猛

1.上海市公安局物证鉴定中心 上海市现场物证重点实验室，上海 200083；2.上海市刑事科学技术研究院上海市现场物证重点实验室，上海 200083；3.上海市公安局嘉定分局刑事科学技术研究所，上海201800

叠氮化钠又称叠氮钠，可经呼吸道、消化道和皮肤迅速吸收，属于剧毒物质，与氰化物类似。研究结果[1-5]表明，其主要抑制细胞色素氧化酶和其他酶，并能使体内氧合血红蛋白形成受阻，具有黏膜刺激、降压、中枢神经损害及强致突变作用。

KAGE 等[6]研发的五氟苄基溴（pentafluorobenzyl bromide，PFBBr）衍生化检测血液和尿液中叠氮化物具有检材用量少、预处理简单等优点，但此方法采用水浴的衍生化方式耗时较长，难以满足司法实践中的快速筛查及鉴定要求。本研究拟在已有的研究[6-8]基础上，参照上述的五氟苄基溴衍生化方法，以微波辅助的衍生化方式，建立血液中叠氮离子的气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定方法，并应用于实际案例。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

5977B GC/MSD型气相色谱-质谱联用仪（配自动进样器及NIST17.L 质谱数据库，美国Agilent 公司），HP-5MS 石英毛细管色谱柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm；美国Agilent 公司），Vortex-Genie 2 型漩涡混合器（美国Scientific Industries 公司），Elga Option-R7 超纯水机（英国Elga 公司），SC-2544 型离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），WP800SL23-2 型微波炉（输出功率为800 W，广东格兰仕集团有限公司）。

1.2 主要试剂与标准品

叠氮化钠标准品（NaN3，国药集团化学试剂有限公司），氰化钠标准品（NaCN，国药集团化学试剂有限公司），PFBBr（纯度99%，德国Merck 公司），十四烷基二甲基苄基氯化铵（tetradecyl dimethyl benzyl ammo⁃nium chloride，TDMBA；纯度98%；日本东京化成工业株式会社），四硼砂钠（Na2B4O7，纯度98%；美国Acros Organics 公司），乙酸乙酯（分析纯，上海凌峰化学试剂公司），去离子水由Elga Option-R7 超纯水机制备。空白血液来自上海市公安局物证鉴定中心案例中6 份常见毒（药）物筛选阴性的血液样品。

1.3 溶液的配制

叠氮离子标准溶液：称取叠氮化钠标准品适量，用乙酸乙酯溶解成质量浓度为1 mg/mL 的叠氮离子标准溶液。

氰离子内标溶液：称取氰化钠标准品适量，用乙酸乙酯溶解成质量浓度为1 mg/mL 的氰离子标准溶液。

标准添加血液样品溶液：空白血液样品中添加叠氮离子标准溶液，涡旋混匀，分别制成0.5、1.25、2.5、5、10、15、20 μg/mL 系列质量浓度的标准添加血液样品。

饱和Na2B4O7去离子水溶液：称取Na2B4O7足量，加入去离子水250 mL 加热溶解，自然冷却后，取上层清澈溶液备用。

PFBBr 乙酸乙酯溶液：将261 mg 的PFBBr 溶解在50 mL 乙酸乙酯中，质量浓度为5.22 mg/mL。

TDMBA 去离子水溶液：将184 mg 的TDMBA 溶解在100 mL 饱和Na2B4O7去离子水中，质量浓度为1.84 mg/mL。

1.4 仪器测试条件

色谱条件：HP-5MS 石英毛细管色谱柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）。起始50 ℃保持3 min，以10 ℃/min 升至220 ℃，保持5 min；进样口温度260 ℃；氦气（He）作为载气，流速1.0 mL/min，分流进样，分流比20∶1。

质谱条件：电子轰击（electron impact，EI）离子源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围m/z40～650。以全扫描模式进行定性分析；以选择离子监测模式进行定量分析，叠氮离子的五氟苄基衍生物（pentafluorobenzyl azide，PFBN3）的定量离子为m/z194，内标氰离子衍生化后生成五氟苯乙氰（pentafluo⁃robenzyl cyanide，PFBCN），其定量离子为m/z207，溶剂延迟6 min。

1.5 样品前处理

取血液0.2 mL 置于10 mL 玻璃试管中，添加2 μL氰离子内标溶液，加入0.5 mL的PFBBr乙酸乙酯溶液，加入0.8 mL 的TDMBA 去离子水溶液，涡旋混合15 s，微波低火档加热3 min，以离心半径6 cm，3 000 r/min，离心2 min，吸取100 μL 有机相进行GC-MS 分析，衍生化过程如图1 所示。

图1 衍生化过程Fig.1 Derivation process

1.6 衍生化条件的选择优化

通过调整PFBBr 乙酸乙酯溶液和TDMBA 去离子水溶液的添加体积，以及衍生化反应的时间来优化衍生化条件。在其他衍生化条件不变的情况下，分别添加0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mL 的PFBBr，来考察衍生化试剂总量对于结果的影响。同理，分别添加0.1、0.3、0.5、0.8、2.0 mL 的TDMBA，来考察相转移催化剂总量对于结果的影响。在微波低火衍生化的过程中，选择不同的反应时间（1、2、3、5 min）来优化衍生化时间。当PFBN3和PFBCN 的峰面积比不随衍生化试剂、催化剂和衍生化反应时间的增加而改变时，表明衍生化反应达到平衡。

1.7 方法验证

1.7.1 选择性

取6 份空白血液，按“1.5 节”方法处理后分析。

1.7.2 线性关系及检测限

标准添加血液样品溶液中叠氮离子质量浓度范围为0.5～20 μg/mL，按“1.5 节”方法操作，以PFBN3和PFBCN 的峰面积比（y）为纵坐标，以空白血液中叠氮离子添加质量浓度（μg/mL）为横坐标（x）进行线性回归。按信噪比3∶1 确定最低检测限，按信噪比10∶1 确定最低定量限。

1.7.3 精密度及相对回收率

取标准添加血液样品低、中、高3 个质量浓度（分别为1.25、5、15 μg/mL），每个质量浓度平行6 个样品，按“1.5 节”方法操作。计算每个浓度样品的日内相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）和平均相对回收率。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的选择

对于GC-MS 检验分析来说，较为理想的内标物应该是分析物的氘代物，叠氮离子的氘代物价格十分昂贵且来源困难，本研究选择氰离子作为内标物，考虑到它和叠氮离子结构中都有稳定的共轭三键结构，体内代谢过程中可以检测到原体，其衍生化方式、衍生化产物的色谱行为和质谱碎裂也较为相似。当检测血液中氰离子时，亦可以反向选择叠氮离子作为内标物。

本研究考察了衍生化试剂的用量，当增加PFBBr用量时，衍生化效果更佳，但衍生化试剂量过大，有机相中剩余衍生化试剂对色谱行为产生干扰，本底信号过强，对检测可能造成干扰。结果表明，PFBN3与PFBCN 的峰面积比值随衍生化试剂PFBBr 用量的增大而增大，当衍生化试剂用量大于0.5 mL 时，PFBN3和PFBCN 的峰面积比基本恒定、不随衍生化试剂用量的增加而改变。因此，本研究选择质量浓度为5.22 mg/mL 的PFBBr 乙酸乙酯溶液0.5 mL。

本研究考察了催化剂的用量，当催化剂过量时，剩余催化剂会对色谱行为产生干扰。在能满足衍生化反应进行的条件下，应当减少催化剂用量。结果表明，当催化剂用量大于0.8 mL 时，PFBN3和PFBCN 的峰面积比基本恒定且不随催化剂用量的增加而改变。本研究选择催化剂用量为0.8 mL。

微波低火衍生化方式下，当衍生化时间为3 min以上时，PFBN3与PFBCN 的峰面积比不随衍生化时间的增加而增大，表明衍生化反应已经达到平衡。能够保证衍生化反应完全进行的前提下，本研究衍生化时间选择微波低火3 min 以达到快速鉴定的目的。

2.2 方法验证

在优化后的衍生化条件下，标准添加血液样品溶液衍生化的的总离子流色谱图（图2A）中在保留时间为8.800 min 和9.558 min 时分别出现目标物PFBN3和内标物PFBCN 的特征色谱峰，空白血液样品衍生化的总离子流色谱图（图2B）中未见衍生化产物PFBN3的特征色谱峰，可以排除空白血液样品内源性基质干扰。标准添加血液样品中PFBN3及PFBCN 的质谱图（图3）显示，PFBN3质谱图中丰度最高的为m/z181 的碎片离子，但由于m/z181 也是PFBBr 的特征碎片离子，故选择响应强度次之的m/z194 作为定量离子。PFBCN 质谱图中丰度最高的为其分子离子m/z207，在本研究中选择其作为PFBCN 的定量离子。

图2 衍生化总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram after derivatization

图3 标准添加血液样品的质谱图及结构图Fig.3 Mass spectrum and structure diagram of standard addition blood samples

血液中叠氮离子质量浓度在0.5～20 μg/mL 时，与PFBN3和PFBCN 的峰面积比的线性关系良好，得到的标准曲线回归方程为：y=0.197 292x+0.005 940（r=0.993 1）。最低检测限为0.25 μg/mL，最低定量限为0.50 μg/mL。

平均相对回收率为92.76%，日内RSD 为4.21%，可满足法医毒物学检验要求，结果见表1。

表1 血液中GC-MS选择离子监测下衍生化分析的精密度和RSDTab.1 Precision and RSD of GC-MS selected ion detection derivatization analysis in blood（n=6，%）

2.3 案例应用

某案例中，于案发现场发现一个空的体积为1 mL黑色离心管，结合调查死者曾从实验室拿过叠氮化钠，怀疑服用叠氮化钠中毒死亡。提取死者血液样品送检，按照本研究建立的检测方法，在送检血液检材中检出叠氮离子成分，其质量浓度为11.11 μg/mL。

2.4 小结

本研究选用氰离子为内标物，PFBBr 为衍生化试剂，TDMBA 为相转移催化剂，在微波低火档3 min 的衍生化条件下，将叠氮离子和内标氰离子衍生化为PFBN3和PFBCN 进行GC-MS 分析，建立了血液中叠氮离子的五氟苄基衍生化GC-MS 检测方法。该方法操作简便，快速、灵敏，能对血液中叠氮离子进行检测，并成功应用于实际案例，可以满足司法鉴定工作的检验要求。