外感二号合剂中葫芦素B的鉴别和含量测定*

蓝晓步，植国繁，许崇摇，黄兴振，吴 瑞，卢文汐，秦艳娥Δ

（1.广西南宁市第一人民医院，南宁 530022；2.广西医科大学，南宁 530022）

外感二号合剂是山芝麻、鸭脚木、白点称（岗梅）等多味药材组成的医疗机构制剂。该合剂为南宁市第一人民医院老中医根据广西南宁的地域和气候特点而研制的验方，经制剂室科学配制而成的纯中药制剂，取得批准文号（桂卫药制字［1999］010067）并用于临床。该合剂在院内临床应用已有多年，经临床验证治疗外感风热所致的发热、咽炎、支气管炎等有明显疗效，具有清热解毒、解表利咽的功效[1]。石玲东等[2]通过临床观察研究发现，运用苦柏洗剂联合外感二号合剂治疗普通型小儿手足口病具有显著疗效，对患儿口腔疱疹具有一定的治疗作用，可促进病情恢复。方中山芝麻为君药之一，收载于《广西壮药标准》第一卷[3]，性苦寒，味辛且苦，具有解表清热、解毒消肿功效[4]。为有效地控制外感二号合剂的质量，本实验通过研究建立了以山芝麻中葫芦素B为指标的薄层色谱（TLC）鉴别及高效液相色谱（HPLC）含量测定方法，该方法可以作为外感二号合剂的质量标准之一。

1 材料与方法

1.1 仪器

ZF-8型四用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ULUP-I-10 型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；XS-205DU型十万分之一电子天平。

1.2 试剂

葫芦素B对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111945-201301）；外感二号合剂（南宁市第一人民医院自制，批号分别为191101，200401，210101，规格为每瓶100 mL）；海洋牌硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂，批号20181216）；乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂为分析纯，超纯水（自制）。

1.3 TLC鉴别

1.3.1 条件 薄层色谱填料以硅胶G 为吸附剂，展开剂[5]：甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1），温度28 °C，湿度40%，喷显色剂10%硫酸乙醇溶液后，105°C加热后置于365 nm紫外灯下检视。

1.3.2 溶液的制备（1）供试品：取本品10 mL，加入60%乙醇40 mL，加热回流1 h。过滤，置水浴中蒸干蒸干。残渣加10 mL蒸馏水溶解。再用乙酸乙酯萃取2次，每次30 mL。合并萃取液，置水浴中蒸干，残渣加甲醇1 mL 溶解，作为供试品溶液。（2）对照品[6]：精密称取葫芦素B适量，加甲醇溶解，定容，并稀释成每1 mL 含葫芦素B 1 mg 的对照品溶液。（3）对照药材：称取山芝麻对照药材约5 g，依法制备对照药材溶液。（4）阴性样品：按处方制成缺山芝麻的阴性样品溶液。取相当于供试品量，依法制成阴性样品溶液。

1.3.3 点样、展开、显色 按照薄层色谱法[7]试验，分别吸取葫芦素B 对照品、供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液各5 μL点于同一块硅胶G预制板上，以甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷显色剂10%硫酸乙醇溶液后105°C加热15 min 后置于365 nm 紫外灯下检视。外感二号合剂供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图1。

2 HPLC 含量测定方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为JADE-PAK ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相[8]为乙腈-0.1%醋酸（46∶54，v/v）。流速定为1.0 mL/min，检测波长设为228 nm[9-12]，注温为室温，进样量设为10 μL。

2.2 溶液的制备

（1）对照品溶液的制备：精密称取葫芦素B 适量，加甲醇溶解，定容，并稀释成每1 mL含葫芦素B 1 mg 的对照品溶液[6]。（2）供试品溶液的制备：精密量取本品30 mL，加入60%乙醇适量，加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，加适量蒸馏水溶解。再用乙酸乙酯萃取2 次，每次30 mL。合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇适量，转移置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试溶液。（3）阴性样品溶液的制备：按外感二号合剂处方比例，除不加入山芝麻药材外，依法制成缺山芝麻药材的阴性样品，同法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取对照品溶液、供试溶液及阴性样品溶液，按拟定色谱条件进样10 μL，进行系统适用性试验，记录色谱图。与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对称因子为0.98，理论塔板数按葫芦素B 计不低于5 000，见图2。通过色谱图对比，供试品中葫芦素B的色谱峰与对照品色谱峰的保留时间基本一致，且阴性样品在对应的位置上无色谱峰干扰。

图2 HPLC图

2.4 线性关系考察

精密称取葫芦素B 对照品，甲醇溶解，定容，配置成浓度为0.01 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.60 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL的标准溶液，按拟定色谱条件进行测定。以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X，mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得葫芦素B的回归方程为Y=13 042 172.64X－59 373.34，r=0.999 9。葫芦素B 质量浓度在0.01～1.00 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

取同一份对照品溶液，按拟定色谱条件分别连续进样测定6次，记录各峰面积，结果葫芦素B色谱峰面积的RSD值为0.28%，表明仪器精密度较好。

2.6 稳定性试验

取同一批样品（批号200401）配制的供试品溶液，按拟定色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h进样，记录葫芦素B吸收峰的峰面积，结果葫芦素B色谱峰面积的RSD值为0.61%（n=6），表明供试品的稳定性较好。

2.7 重复性试验

取同一批次样品（批号200401）6 份，同法制备供试品溶液，按拟定色谱条件平行测定6 次。结果葫芦素B的RSD值为0.72%，表明方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的外感二号合剂（批号200401）6 份，每份15 mL，每份精密加入相同量的葫芦素B，同法制备供试品溶液，按拟定色谱条件分别进样测定，计算葫芦素B 的平均回收率。葫芦素B 的平均回收率为99.49%（RSD=1.77%，n=6），见表1。

表1 葫芦素B的加样回收率试验结果 n=6

2.9 样品含量测定

分别取3 个批号外感二号合剂各2 份，同法制备供试品溶液。按拟定色谱条件进样测定，每份样品测定2 次，计算外感二号合剂中葫芦素B 的平均含量，见表2。

表2 外感二号合剂中葫芦素B含量测定结果 n=2

3 讨论

3.1 质量评价指标的选择

由于外感二号合剂现行的质量标准较低，仅有性状检查，缺乏TLC 鉴别和含量检查，不符合现代中药制剂的质量管理要求，笔者拟通过本研究以提升该合剂的质量标准。方中的山芝麻作为君药之一，具有解清热、消肿解毒等功效[4]。山芝麻临床上多用于治疗由风热感冒引起的症状，例如全身酸痛、鼻塞、咽喉红肿热痛、流涕、支气管炎、发热头痛等[13-15]。本研究曾对山芝麻中齐墩果酸的含量开展了HPLC 方法测定相关成分含量的研究工作，但由于处方药味较多，相互干扰太大，经文献研究[16-17]发现，该合剂中的鸭脚木皮和白点称（岗梅）这两味药材成分均含有齐墩果酸成分。有文献报道[18]，葫芦素B 为山芝麻的主要有效成分之一，通过实验研究发现，葫芦素B 在该合剂中可以区别于其他药材的专属性成分，故以葫芦素B 作为外感二号合剂的质量评价指标，可作为特异性指标控制外感二号合剂的质量。

3.2 展开剂体系的摸索

TLC 实验中，对环己烷—乙酸乙酯—甲酸（10:10:0.5）[19]和甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）[5]两种展开剂系统进行了比较，相同条件下甲醇的提取效果最佳。甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）这一展开剂体系的色谱图中斑点更清晰、分离度更好。故选取甲苯—乙酸乙酯—冰醋酸（7∶2∶1）作为展开剂。

3.3 流动相的选择

参考文献中[8]葫芦科植物药材中葫芦素类成分的含量方法，曾选用乙腈-0.1%醋酸（49∶51，v/v）作为流动相，结果发现葫芦素B和供试品的峰形不好，且拖尾严重。采用不同比例的乙腈-0.1%醋酸系统，对葫芦素B对照品及样品的出峰时间、理论板数、分离度和峰形等进行了比较。最终选择了乙腈-0.1%醋酸（46∶54，v/v），其保留时间适合，分离度合格，比例拖尾情况较轻，理论塔板数按葫芦素B 计不应低于5 000。

3.4 色谱柱的选择

曾采用Phenomenex Luna®C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、JADE-PAK ODS-AQ 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色谱柱分别进行样品溶液的测定。以Phenomenex Luna®C18柱测得样品溶液色谱图中保留时间虽较良好，但其色谱峰形不好，因而没有采用；而Kromasil 100-5C18柱测得的样品溶液色谱图中峰形比较差，故不予选用；JADE-PAK ODS-AQ色谱柱测得样品溶液的葫芦素B 保留时间适合，且与前后杂质峰分离效果均良好，分离度均大于1.5，符合《中国药典》的规定。

3.5 方法评价

本研究中首次对外感二号合剂中山芝麻中药材的葫芦素B 进行定性鉴别及含量测定，建立的方法具有简便快捷、稳定性好、准确度高、专属性强等特点，可作为外感二号合剂定性及定量的质量标准。