基于正交试验补嘘养勒颗粒提取制备工艺研究*

何天富，方 刚，陈晓艺，李清平，罗宇东，秦超燕

（1.广西中医药大学制药厂研发部，南宁 530001；2.广西中医药大学壮医药学院，南宁 530001；3.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530001）

产后缺乳为常见产后病，始于《诸病源候论》记录为“产后乳无汁候”[1]。有学者探讨气血虚弱、肝郁气滞、痰湿壅盛是引起该病症重要原因[2]。目前没有针对产后缺乳明确的诊疗方案，常以中药汤剂及针灸作为主流治疗手段[3-6]，而壮医治疗产后缺乳方面有显著特色[7]。补嘘养勒方为借鉴名老中医的学术思想，根据壮医药理论开发的治疗产后缺乳的经验方，临床应用效果良好。补嘘养勒方由五指毛桃、当归、田七、麦冬、川芎、木瓜组成。课题组在此理论和有效的临床应用基础上，采用现代科学技术，对补嘘养勒方进行优化，通过提取、制备工艺的研究，将补嘘养勒方优化成质量可控、稳定，疗效确切，方便携带的补嘘养勒颗粒，为后期的生产制备提供实验依据。

1 材 料

1.1 仪器设备

LC-2030C 3D 型高效液相色谱仪（岛津中国仪器有限公司）AG135 型电子天平（梅特勒—托利多仪器有限公司）；202-2 型电热恒温干燥箱（江苏省通州市）；S205DU 型电子天平（梅特勒—托利多仪器有限公司）。

1.2 药品

阿魏酸（中国食品药品检定研究所，110773-201614，含量以99.0%计）；补骨脂素（中国食品药品检定研究所，110739-201617，含量以99.70%计）；甲醇、乙腈；蔗糖、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、甜菊素（购自南宁市越前食品添加剂有限责任公司)。五指毛桃、当归、田七、麦冬、川芎、木瓜药材均采购于广西仙茱中药科技有限公司，经广西中医药大学制药厂质量保证部检验合格。

2 方法与结果

2.1 提取工艺的优化

采用正交试验设计，以加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）作为考察因素，以提取液中得膏率、阿魏酸和补骨脂素的含量作为评价指标，运用L9（34）设计补嘘养勒颗粒提取工艺的优化筛选。实验因素水平，见表1。

表1 正交实验因素水平表

2.2 HPLC法测定补嘘养勒颗粒处方提取液中阿魏酸、补骨脂素的含量

2.2.1 供试品溶液的制备 按照处方量称取各药材，加入8倍水量浸泡30 min，煎煮3次，60 min/次，200 目滤布过滤，浓缩成清膏，定容至250 mL，备用。取清膏5.0 mL，加70%甲醇定容至25 mL，超声提取40 min，放冷，补液，滤过，取续滤液过微孔滤膜（0.22 μm），即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取阿魏酸、补骨脂素适量，加入适量70%甲醇溶解，使阿魏酸浓度为18.31 μg/mL、补骨脂素浓度为9.70 μgmL。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按补嘘养勒颗粒处方比例称取缺五指毛桃、川芎和当归的药材，分别按处方工艺提取，再按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制备，即得。

2.2.4 色谱条件与系统适应性试验色谱条件 色谱柱为Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～7 min，20%A；25 min，40%A；30 min，50%A；40 min，90%A）；检测波长：244 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量10 μL。理论塔板数按阿魏酸峰计算不低于3 000，按补骨脂素计算不低于3 000。补嘘养勒颗粒提取液色谱图，见图1。

图1 补嘘养勒颗粒提取液色谱图

2.2.5 标准曲线的绘制 分别将混标母液稀释成适量的浓度，按上述色谱条件测定，以峰面积为横坐标（Y），以进样浓度为纵坐标（X）进行线性回归，阿魏酸回归方程为Y=30192X-1454.7，R2=0.999 9，阿魏酸在3.66～21.97 μg/mL 的范围内呈良好的线性关系；补骨脂素回归方程为Y=70 503X-3 048.4，R2=0.999 9，补骨脂素在1.94～11.64 μg/mL的范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度实验 精密吸取混标溶液，按色谱条件测定，连续进样6次。阿魏酸RSD值为1.95%，补骨脂素RSD 值为1.90%，均小于2%，说明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性实验 取供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 按色谱条件测定。阿魏酸RSD值为1.95%，补骨脂素RSD值为1.90%，均小于2%，实验结果表明样品在24 h内较稳定。

2.2.8 重复性实验 取清膏，按照“2.2.1”项制备6份供试品溶液并按色谱条件测定，阿魏酸RSD值为1.79%、补骨脂素RSD 值为1.79%。实验结果表明重复性良好。

2.2.9 加样回收实验 精密量取已知含量的供试品适量，按照1∶0.5、1∶1、1∶1.5 的比例加入混标溶液，按“2.2.1”项下提取并按色谱条件进行测定，计算加样回收率。实验结果表明，阿魏酸的平均回收率为99.40%，RSD 值为2.83%，补骨脂素的平均回收率为100.53%，RSD值为2.91%。

2.3 正交试验

根据正交因素水平表设计L9（34）试验，按照“2.1.2”项建立的方法测定供试品溶液中阿魏酸、补骨脂素的含量以及得膏率。以得膏率的含量（X1）加权系数设为0.2，每个处方中阿魏酸（X2）、补骨脂素（X3）的含量指标加权系数设为0.4，综合评分（Y）=（0.2X1+0.4X2=0.4X3）。实验设计及结果，见 表2、表3。由方差结果可知，水煎煮提取工艺实验各因素对中影响提取次数＞加水量＞提取时间，只有提取次数对考察指标有显著性差异，结合直观分析结果综合考虑，确定最佳提取工艺为A3B1C3，即加入10倍水量，提取3次，提取时间为30 min。

表2 L9（34）水提工艺正交实验及结果表

表3 方差分析结果表

按照处方量称取各药材，平行制备3份，按优选提取工艺参数进行实验，并测定得膏率为3.61%、每个处方量中含有24.04 mg 阿魏酸和11.34 mg 补骨脂素。实验结果表明，该提取工艺基本稳定可行。

2.4 成型工艺研究

2.4.1 辅料的选择 按最佳提取工艺得到的药液，经浓缩、干燥得浸膏粉，根据表4的比例将辅料与浸膏粉混匀后制成颗粒的收率、溶化性及口感来选择恰当辅料，结果见表5。颗粒收率的测定：将制备好的颗粒称重。颗粒收率=合格颗粒重量（g）/[浸膏粉重量（g）+辅料重量(g)]×100%。溶化性的测定：在干燥恒重的5 mL离心管中加入精密称定的颗粒，精密加入沸水5 mL，搅拌振荡5 min，3 000 r/min 离心15 min，弃去上清液，在80 ℃将残渣烘干至恒重，精密称定，计算溶化率。溶化率=溶化颗粒质量/颗粒质量×100%。口感等级：苦味较重、味甜而微苦。根据辅料筛选实验结果，确定辅料为蔗糖。

表4 辅料筛选实验

表5 辅料筛选结果

2.4.2 成型工艺的选择

根据影响成型工艺过程中存在的诸多因素，考虑乙醇浓度、乙醇用量和搅拌时间设计了因素水平及L9(34)正交试验表，见表6、表7。以颗粒收率作为评价指标。根据方差分析结果可知，3 个因素对颗粒收率的影响程度大小依次为A＞B＞C，且因素A、B 差异有统计学意义（P＜0.05），见表8。根据直观分析结果确定最佳工艺为A2B2C3，经重复最佳工艺条件A2B2C3试验，得到颗粒收率与正交表试验结果基本一致，故确定成型工艺为乙醇浓度75%，乙醇用量8%，搅拌15 min。

表6 因素水平表

表7 L9(34)正交试验表

表8 方差分析结果

2.5 颗粒成型工艺的评价

按最佳提取、成型工艺制备3批样品，进行颗粒成型工艺评价。

2.5.1 粒度的测定 按照《中国药典》2015年版第四部粒度和粒度分布测定法（通则0982第二法双筛分法)测定粒度。3批样品的粒度比例分别为14.27%、11.62%、12.30%，平均值为12.73%。试验结果表明，未通过一号筛和通过五号筛的颗粒及粉末占颗粒的12.73%，＜15%，符合规定。

2.5.2 水分的测定 按照《中国药典》2015 年版第一部（附录XH）水分测定法第一法（烘干法）测定供试品中含水量（%）。3批样品的水分检测结果分别为5.18%、5.63%、4.79%，平均值为5.20%。试验结果表明，样品水分的在4.8%～5.7%之间，小于8%，符合规定。

2.5.3 溶化性的考察 取本品10 g，加热水200 mL，搅拌5 min，立即观察，颗粒全部溶化有轻微浑浊，符合规定。

2.6 中试资料

按筛选出的处方工艺放大100倍进行中试3批，其批号分别为20200701、20200702、20200703。每批按照1∶100 比例称取原料。加10 倍量水提取3 次，30 min/次，过滤，滤液浓缩至相对密度1.10～1.15（80 ℃）的清膏，加入乙醇使含醇量达70%，搅拌，静置12 h，滤过，滤液浓缩成稠膏，干燥，粉碎过100目筛，加入蔗糖粉及乙醇，混合均匀，制成颗粒，干燥，总混机混合均匀，分装，包装，分别对所得颗粒样品的颗粒收率、粒度和溶化性进行统计，3批中试的颗粒收率分别为95.40%、95.20%、94.40%，粒度为12.41%、13.18%、12.73%，溶化性均良好。

3 讨论

补嘘养勒方是由五指毛桃、当归、田七、麦冬、川芎、木瓜组成的。主药中的五指毛桃又名南芪、五爪龙、五指牛奶，为桑科植物粗叶榕的干燥根。经现代医学研究发现，五指毛桃中富含补骨脂素、佛手柑内酯、芹菜素等[8-9]。其中，补骨脂素的含量是五指毛桃主要质量控制指标[10-12]。当归，别名干归、秦哪等，是最常用的中药之一，具有补气益血，调经止痛，润燥滑肠的功效。目前的研究对当归的质量控制等相关研究不胜枚举，当归中含有洋川芎内酯、阿魏酸、阿魏醛、藁本内酯等[13-14]。阿魏酸的含量是控制当归质量的重要指标[15-17]。本课题组前期研究发现，补嘘养勒提取液中含有补骨脂素、阿魏酸、洋川芎内酯等，其中补骨脂素、阿魏酸的含量较高，结合方中主药的化学成分研究理论基础，以补骨脂素、阿魏酸含量作为补嘘养勒方的质控指标。

课题组建立了补嘘养勒颗粒提取液中阿魏酸、补骨脂素的含量测定方法，实验结果发现，阿魏酸在3.66～21.97 μg/mL的范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=30192X-1454.7（R2=0.999 9），补骨脂素在1.94～11.64 μg/mL 的范围内呈良好的线性关系回归方程为Y=70503X-3048.4（R2=0.999 9），平均加样回收率分别为99.40、100.53%，精密度、稳定性等试验均符合相关要求。此外，为了验证制定的含量测定方法的耐用性，课题组还分别考察了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇不同溶媒对提取液中阿魏酸、补骨脂素含量的影响，结果显示，70%甲醇具有较好的提取效果；考察了不同流动相（乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈－水）、不同流速（0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min）的分离效果，综合阿魏酸、补骨脂素含量的结果及相应色谱峰的分离度等，最终确定以乙腈-0.1%磷酸作为流动相，以1.0 mL/min作为实验条件的流速下。并运用该色谱条件在不同的色谱柱上进行验证，结果显示，该色谱条件运用在不同厂家的色谱柱[Agilent ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm，5 μm）]上，阿魏酸和补骨脂素均具有较好的分离效果。

通过正交试验，以得膏率、活性成分阿魏酸、补骨脂素的含量为评价指标，优化提取条件，通过验证性实验，确定最佳提取工艺：加入10倍水量，提取3次，提取时间为60 min；常用的中药颗粒剂的稀释剂、主要有蔗糖、糊精、淀粉、乳糖、甘露醇、微晶纤维素等[18]，结合前期课题组的预实验研究，选择乳糖、微晶纤维素、甘露醇、甜菊素、蔗糖作为辅料进行考察。通过颗粒收率、溶化率及口感结果，确定蔗糖作为补嘘养勒颗粒的辅料，并以颗粒收率评价乙醇浓度，加入量以及搅拌时间对成型工艺的影响，确定最佳成型工艺为：75%乙醇浓度，乙醇用量8%，搅拌15 min。

本研究建立的补嘘养勒颗粒提取物阿魏酸、补骨脂素的含量测定方法准确、灵敏、可靠、重现性好；优选的最佳的提取工艺条件、成型工艺条件稳定可行，为后期的研发奠定基础。