携带角质细胞生长因子和低氧诱导因子-1α双基因减毒沙门菌的遗传稳定性

李欣，魏静，蒋如如，哈小琴

1.甘肃中医药大学临床医学院临床检验诊断学，甘肃 兰州 730030；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四○医院检验科，甘肃 兰州 730050；

20世纪70年代提出了基因治疗的方法，近年逐步显示出良好的临床效果。多数情况下，基因治疗是将遗传物质导入靶细胞以达到治疗目的［1］。基因治疗由于少数患者出现严重副作用，使其应用受限，随着对基因相关分子和细胞机制的深入了解，研发了复杂的基因转移工具，极大提高了基因治疗的安全性和治疗效果［2］。

减毒沙门菌作为基因治疗的活载体，具有巨大的研发潜力，在人类和兽医学中应用广泛，随着对细菌的遗传学、生物学和致病机理的深入了解，使针对特定应用沙门菌构造的设计更合理［3］。本实验采用的减毒沙门菌为减毒伤寒沙门菌Ty21a，是目前唯一用于制备人类疾病预防产品的减毒疫苗株，可提高机体免疫力，安全性较高［4］。Ty21a的致病性虽较低，但仍具有较高的侵袭性，口服后可在胃肠道黏膜定植［5］。针对该特性，本课题组前期实验将角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）及低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）基因连接至质粒p IRES-SEQ中，构建重组质粒p IRESHIF-IRES-KGF，电转入减毒沙门菌Ty21a中，成功构建了携带KGF及HIF-1α双基因的减毒沙门菌（Ty21a-pIRES-HIF-KGF，TPKH）。KGF可促进上皮细胞增殖，具有维持和恢复受损伤胃肠黏膜的完整性的作用［6］；HIF-1α可使缺氧组织细胞保持一定的氧浓度，使细胞能耐受低氧状态而存活［7］。由于质粒p IRES-SEQ含有氨苄青霉素（Amp）基因位点，TPKH既可在Amp（+）LB平板上生长，以此筛选阳性菌落，又可在Amp（-）LB平板上生长。本实验通过目的基因片段的大小和目的蛋白的表达水平来评价TPKH的遗传稳定性，为后续大量生产提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及细胞 携带KGF和HIF-1α双基因的TPKH由甘肃省干细胞与基因药物重点实验室提供；大鼠小肠上皮隐窝细胞（intestinal crypt cells，IEC-6）购自中国科学院上海细胞库；Ty21a菌株购自中国食品药品检定研究院。

1.2 主要试剂 Premix TaqTM、DNA marker DL2000及500 bp DNA marker购自日本TaKaRa公司；琼脂糖、TAE电泳缓冲液及质粒小提试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；SuperRed／GelRed核酸染色液购自北京白鲨生物技术有限公司；氨苄西林钠购自石家庄华北制药集团；鼠KGF及鼠HIF-1αELISA试剂盒购自上海江莱生物有限公司；革兰染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）购自美国Gibco公司。

1.3 菌株传代 取100μL初始代TPKH菌株，接种于10 mL的LB培养液中，于37℃恒温振荡器中培养至A600约0.6时，取100μL菌液，采用四区划线法分别涂布于Amp（+）和Amp（-）的LB固体培养板上，置37℃孵箱中培养24 h；分别取生长良好的单克隆菌落，置10 mL Amp（+）和Amp（-）的LB液体培养基中，于37℃恒温振荡器中培养至A600约0.6，即为第1代菌株。按该方法连续传40代。

1.4 菌体及菌落形态观察 肉眼观察10、20、30、40代菌落形态。同时取1滴0.9%氯化钠溶液置于盖玻片上，用接种环挑取10、20、30、40代菌落，加入0.9%氯化钠溶液中，制作涂片，置酒精灯上方快速过3次，固定，进行革兰染色，立即镜下观察。

1.5 菌落P C R检测 挑取5、10、15、20、25、30、35、40代菌落至0.2 mL PCR管中，加入10μL灭菌蒸馏水，混匀，盖紧。100℃煮沸5 min，-20℃冷冻5 min，重复2次。2 795×g离心5 min，取上清，作为DNA模板，进行目的基因和真核表达启动子CMV的扩增。启动子CMV上游引物：5′-CCCAGTACATGACCTTATGGG-3′，下游引物：5′-GGAGACTTGGAAATCCCC-GT-3′，扩增产物大小为140 bp；KGF基因上游引物：5′-TGATCTAGAATGAGCTATGATTACATGGAAG-3′，下游引 物：5′-GACGCGGCCGCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3′扩增产物大小为443 bp；HIF-1α基因上游引物：5′-CATGCTAGCCACCGATTCACCATGGAGGGC-3′，下游引物：5′-GTCACGCGTTCAGTTAACTTGATCC-AAAGCTCTG-3′，扩增产物大小为2 492 bp。PCR反应体系为：Premix Taq 25μL，cDNA模板1μg，上、下游引物各1μL，灭菌蒸馏水补充至50μL。PCR扩增条件为：95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 质粒浓度及纯度的测定 取10、20、30、40代菌落各1 mL，用质粒提取试剂盒提取质粒，通过紫外分光光度计测定A260及A280值，计算浓度和纯度。

1.7 转染时间对I E C-6细胞中K G F和H I F-1α蛋白表达水平影响的检测 将初始代TPKH和Ty21a菌落分别接种于10 mL LB Amp（+）和Amp（-）液体培养基中，37℃恒温摇床中培养至A600为0.6时，2 795×g离心10 min，D-PBS洗涤3次，调整菌液浓度为1×108cfu／mL。将1×106个IEC-6细胞接种于25 cm2细胞瓶中，待细胞贴壁后，分别接种TPKH和Ty21a菌株，同时设PBS组，于37℃孵育2 h；弃菌悬液，D-PBS洗涤3次，加入含10 ng／mL庆大霉素的DMED培养基，继续培养1 h；D-PBS洗涤3次，加入含青-链霉素双抗的完全培养基，继续培养，于培养12、24、48、72 h时，采用鼠KGF及HIF-1αELISA试剂盒分别检测KGF和HIF-1α蛋白的表达水平。

1.8 T P KH代次对I E C-6细胞中K G F和H I F-1α蛋白表达水平影响的检测 取初始代、10、20、30、40代TPKH菌落，按1.7项方法接种至IEC-6细胞，同时设PBS组，培养48 h，采用鼠KGF及HIF-1αELISA试剂盒分别检测KGF和HIF-1α蛋白的表达水平。

1.9 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，试验结果均采用均值±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌体及菌落形态 10、20、30和40代TPKH在Amp（+）和Amp（-）LB平板上的菌落形态基本一致，均为边缘整齐，淡黄色、半透明，光滑湿润的圆形菌落，均为革兰阴性，见图1和图2。

图1 Amp（+）培养基中各代TPKH菌落及菌体形态Fig.1 Morphology of TPKH of various passages in Amp（+）medium

图2 Amp（-）培养基中各代TPKH菌落和菌体形态Fig.2 Morphology of TPKH of various passages in Amp（-）medium

2.2 菌落P C R在Amp（+）和Amp（-）的LB平板上培养的TPKH菌落，均可扩增出140、443及2 492 bp的CMV、KGF及HIF-1α基因片段，大小与预期一致，见图3和图4。表明TPKH在传代过程中无质粒丢失现象，可稳定遗传。

图3 Amp（+）培养基中各代TPKH菌落PCR产物电泳图Fig.3 Electrophoretic profile of colony PCR products of TPHK of various passages in Amp（+）medium

图4 Amp（-）培养基中各代TPKH菌落PCR产物电泳图Fig.4 Electrophoretic profile of colony PCR products of TPHK of various passages in Amp（-）medium

2.3 质粒浓度及纯度TPKH菌株在Amp（+）和Amp（-）培养基的传代过程中，质粒p IRES-HIF-IRES-KGF的浓度及纯度均较稳定，无明显降低，见表1。

表1 各代TPKH菌落中质粒的浓度及纯度Tab.1 Concentration and purity of plasmid in TPKH colonies of various passages

2.4 转染时间对I E C-6细胞中K G F和H I F-1α蛋白表达水平的影响 与PBS组和Ty21a组比较，TPKH组IEC-6细胞中KGF蛋白表达水平在转染后12 h显著升高（F=9.702，P＜0.01），随后逐渐降低（F=0.020～9.690，P＞0.05）；HIF-1α蛋白表达水平于转染后12、24、48 h均显著升高（F=21.186～24.559，P＜0.01），72 h降低（F=4.639，P＞0.05）。见图5。

图5 不同转染时间时IEC-6细胞中KGF（A）和HIF-1α（B）蛋白的表达水平Fig.5 Expression levelsof KGF（A）and HIF-1α（B）in IEC-6 cells after infection for various hours

2.5 T P KH代次对I E C-6细胞中K G F和H I F-1α蛋白表达水平的影响 与PBS组比较，各代TPKH接种IEC-6细胞中的KGF及HIF-1α的蛋白表达水平均明显增加（F=285.616～92.114，P＜0.01）；各代间的KGF及HIF-1α的蛋白表达水平差异无统计学意义（F=0.851～1.846，P＞0.05），见图6。表明代次对TPKH转染细胞后的蛋白表达水平无明显影响。

图6 不同代次TPKH感染IEC-6细胞中KGF（A）和HIF-1α（B）蛋白的表达水平Fig.6 Expression levelsof KGF（A）and HIF-1α（B）in IEC-6 cells infected with TPKH of various passages

3 讨论

机体遭受严重创伤、烧伤、感染时可引起机体缺血、缺氧，从而诱发急性胃肠黏膜糜烂、溃疡，甚至出血和穿孔，该现象称为胃肠应激损伤，是一种较常见的临床疾病［8］。虽然目前的防治方法较多，如抗生素及中药治疗等，但疗效均不佳。研究证实，KGF及HIF-1α能够在机体缺血、缺氧的状态下促进胃肠上皮细胞增殖、局部血管形成及胃肠道黏膜损伤愈合等，具有良好的防治缺血、缺氧引起胃肠应激损伤的功能［9-10］。

KGF是成纤维细胞生长因子家族的一员，又称为成纤维细胞生长因子7（fibroblast growth factor-7，KGF7），是一种间充质细胞衍生的旁分泌生长因子，参与表皮的稳态调节［11］。研究证实，在低氧状态下，KGF对胃肠上皮细胞生长和维持有许多有益的作用，既能够增强胃肠上皮的屏障功能，又能促进胃肠上皮细胞的增殖，减轻胃肠黏膜损伤［12］。HIF-1α是HIF-1的亚基，可被低氧诱导，常氧下含量较少，当机体处于低氧状态时，HIF-1能够高表达［13］。近年研究证实，在缺氧状态下，HIF-1参与血管生成、葡萄糖代谢、细胞增殖、细胞存活等生理反应，增加机体对缺氧的耐受性，保护机体免受低氧的损伤［14-16］。

本实验将TPKH在Amp（+）和Amp（-）的LB平板上连续传40代后，多项检测结果表明，每10代间菌体和菌落的形态基本一致，均符合沙门菌的形态特征；质粒浓度稳定，变化较小，表明传代次数对减毒沙门菌的生长不产生影响，质粒不会随着传代而丢失；传代后TPKH每5代均可扩增出KGF、HIF-1α、CMV基因片段（分别为443、2 492和140 bp），表明在传代过程中，KGF和HIF-1α不会随传代次数的增加而丢失。另外，初始代TPKH转染IEC-6细胞后，KGF和HIF-1α蛋白水平转染12 h时显著上升（P＜0.01），每10代间的蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），表明传代次数不影响TPKH转染细胞后KGF和HIF-1α蛋白的表达。

综上所述，TPKH的遗传稳定性较好，在连续传代40代后，仍能稳定表达其所携带的目的基因，本实验为TPKH制剂的大规模生产奠定了基础。