一种新型载液细胞培养和观察装置的设计及其应用

2021-08-19阮亦铭俞大良

实验室研究与探索 2021年7期

钟正，阮亦铭，俞大良，侯森，2

（1.暨南大学环境学院，广州511486；2.中国科学院南京土壤研究所，土壤环境与污染修复重点实验室，南京210008）

0 引言

激光共聚焦显微镜［1］经过几十年的改进已成为科学研究的重要工具［2］，在生物学、环境学、测量学、医学、材料学中占据了重要地位。由于其卓越的光学层扫和三维构建能力［3］，激光共聚焦显微镜广泛运用于组织和细胞中的分子和结构的检测、细胞内离子浓度变化的测量、荧光相关数据的测量、长时间细胞迁移和生长的观测、三维表面的测量等生物学研究领域中［4-7］。与普通荧光显微镜相比，激光共聚焦显微镜的激发光通过针孔而排除了次级荧光干扰，形成更加清晰的图像［8］。激光共聚焦显微镜可同时对多种荧光染料标记的样本进行信息获取和构建，同时进行局部的光操作［9］。激光共聚焦显微镜要求使用厚度极薄的玻璃片（通常厚度为0.13～0.16 mm）作为样品载物装置［10］。而目前常用的载物装置在使用成本、细胞培养可行性、反复灭菌能力等诸多方面还存在着种种缺陷，无法满足细胞培养观测的使用要求。

激光共聚焦显微镜是在传统光学显微镜的基础上加装激光扫描装置，利用针孔阻断焦距外的光线以排除探测器聚焦外的光线，再利用光栅式扫描进行成像的显微镜［11］。激光共聚焦显微镜采用共轭聚焦的方式，逐点扫描观测样品，从而实现了对荧光标记样品的高分辨三维成像［12］。激光共聚焦显微镜物镜的最前端与聚焦平面的距离（即工作距离）较短［13］，通常需要使用厚度不超过0.17 mm的玻片承载被测物进行实验［14-15］。为了适应这一要求，人们通常采用0.13～0.16 mm的盖玻片来承载被观测物。在观测细胞时，通常做法是首先取细胞悬液滴加到载玻片上，盖上盖玻片，此时细胞位于载玻片和盖玻片之间的狭小空间内；之后将整个载玻片与盖玻片的组合翻转，使得原本处于上方的盖玻片翻到下方，载玻片和盖玻片之间通过细胞悬液的表面张力结合在一起；最后将载玻片与盖玻片的翻转组合置于物镜上方进行观测。这种方法的局限性在于载玻片和盖玻片之间的空间无法密闭，因此难以防止染菌、防尘及防止液体蒸发；此装置加载的液体量有限，无法达到长时间的培养细胞要求；在翻转过程中会导致观测物的搅动及玻片之间的液体溢出从而影响观测结果。另外一种承载器件设计方案是将0.17 mm盖玻片用特殊生物胶粘合在带孔的圆柱形塑料培养皿底部，制成一次性商业化的真核细胞培养载液装置，细胞在底部玻片和带孔培养皿构成的空间内生长。实验时可将此装置直接置于物镜上方进行观测不用翻转。但是这种商业化的器件底部的玻片已经粘合固定，无法对玻片拆下进一步修饰；且器件为不耐高温的塑料制成，不能承受反复高温灭菌，只能一次性使用；器件价格昂贵，使用一次大约花费10元人民币；且需要特殊的支架才能固定于载物台上，并不一定兼容普遍使用的载玻片支架。若能针对目前激光共聚焦显微镜常用观测器件的短板，制备一种能反复灭菌且拆卸方便、价格低廉的、方便固定于载物台操作的面向真核细胞培养的激光共聚焦显微镜载液器件，将会对激光共聚焦显微镜及其相关仪器（如激光共聚焦荧光相关谱仪）的推广，产生极大的推动作用。

本文在以往观察装置的基础上，结合激光共聚焦显微镜的特点，针对细胞培养和重复使用等特性进行研究，设计了一种新型真核细胞培养的载液装置。该载液装置的尺寸按照普通载玻片设计，能够直接适用于各类载玻片支架；并且其成本低廉、可拆装、可重复灭菌使用、使用操作方便。对这种新型载液细胞培养器件进行了制片、灭菌、细胞培养、成像等实验。结果证明，本装置可为激光共聚焦显微镜提供一种可进行真核细胞培养的、能够用于常用的载玻片载物台的、成本低廉的、可重复使用的新型载液器件。

1 材料和方法

1.1 新型载液观察装置

新型载液观察装置由下载器、载物玻片、密封垫、上载器、分离式上盖、固定螺丝组成。装置中厚度为1 mm的下载器、厚度为10 mm的上载器均采用玻璃材质；厚度为0.1 mm的密封垫采用硅胶材质；载物玻片使用面积为24 mm×50 mm，厚度为0.13～0.16 mm

的盖玻片，分离式上盖采用面积为24 mm×75 mm，厚度为1～1.2 mm的载玻片。下载器两侧设有两个对称的圆孔，中间设有较大的圆孔，沿下载器长度中线将下载器分为对称的两块，下载器上方盖有载物玻片。载物玻片上方盖有密封垫，密封垫两侧设有两个对称的圆孔，中间设有较大圆孔。密封垫上方盖有上载器，上载器中间设有较大圆孔，两侧设有两个对称的圆孔，两个对称圆孔上方内侧设有螺纹，螺纹与螺丝配套用于固定组件。接入细胞后，在上载器上方覆盖分离式上盖防止染菌。细胞在载物玻片、密封垫、上载器、分离式上盖组成的密闭空间内培养。

1.2 细胞培养

将HeLa人宫颈癌细胞培养于90%DMEM高糖培养基中（ThermoFisher，中国上海英潍捷基贸易有限公司），培养基中添加10%的胎牛血清（Hyclone/海克隆，中国广州研信生物科技有限公司），1%青霉素/链霉素双抗溶液（Gibco，中国广州研信生物科技有限公司）；细胞培养温度为37℃，含有5%CO2。实验时，首先用磷酸盐缓冲液（PBS，aladdin/阿拉丁，中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司）冲洗细胞，然后加入0.25%胰蛋白酶（0.25 g胰蛋白酶，100 mL PBS（1X），源叶生物，中国上海源叶生物科技有限公司），在37℃、5%CO2的加湿培养箱中培养3 min，再加入DMEM培养基并将细胞从壁上轻轻吹脱，离心去上清液后重新加入DMEM培养基，制成细胞悬液。将细胞悬液加入已消毒的新型载液观察装置中培养。

1.3 细胞染色和成像

培养细胞接种于载液观察装置，培养12、24、36 h后使用普通显微镜（EVOS®FLoid，美国Thermo Fisher Scientific）进行观测。蓝色荧光染料Hoechst 33342能够穿透细胞膜对细胞核进行特异性染色。碘化丙啶（PI）是一种红色荧光的细胞核染色试剂，特异性染色死亡细胞。将细胞接入本装置培养16 h后，移去培养基，加入PBS缓冲液冲洗，然后加入1 mL稀释100倍的双氧水并孵育20 min，加入PBS缓冲液冲洗，再加入含有染色液的培养基孵育20 min，含染色液的培养基为10μL Hoechst33342试剂（1 mg/mL，Solarbio/索莱宝，中国北京索莱宝科技有限公司）与10μL碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）试剂（1 mg/mL，Solarbio/索莱宝，中国北京索莱宝科技有限公司）混匀于1 mL的培养基制备而成，最后使用荧光显微镜（EVOS®FLoid，美国Thermo Fisher Scientific）对染色完成的细胞进行观测。将细胞接入本装置培养12 h后，使用Hoechst33342和PI染色剂对细胞进行染色，然后使用激光共聚焦显微镜（LMS900，德国Zeiss）进行观测。

1.4 灭菌实验

使用灭菌锅（GI36DP，中国厦门至微仪器有限公司）对装置进行灭菌，在温度123℃、气压0.1 MPa情况下灭菌30 min，观察灭菌前后器件形貌的变化。

2 结果与讨论

2.1 新型载液观察装置结构

新型载液观察装置的构造如图1所示，其上载器、下载器采用玻璃制成，在使用过程中不易出现弯曲、变形。密封垫采用硅胶制成，载物玻片上覆盖的密封垫对载玻片和上载器进行贴合密封，可避免液体外泄。载物玻片可用普通盖玻片（0.13～0.16 mm厚度）代替，既可以一次性使用，也可以反复清洗灭菌使用。装置组装时，按照从下到上的顺序将下载器、载物玻片、密封垫、上载器组合，然后使用两颗固定螺丝从下载玻片两侧的圆孔拧入，将组件进行固定。细胞在由载物玻片、密封垫、上载器和分离式上盖构成的圆柱形密闭空间培养。该空间可容纳3 mL细胞培养液。采用硅胶密封垫对载物玻片和上载器进行贴合密封进而有效防止漏液。在上载器上方覆盖分离式上盖以防止液体蒸发、落尘、染菌，使得本装置具有了长时间培养细胞的可行性。

图1 新型载液观察装置结构图（mm）

为了保护构造脆弱的载物玻片，在载物玻片的下方增加厚度为2 mm的玻璃制分离式下载器来支撑整个装置，可以减少由于受力不均而造成载物玻片碎裂的风险。同时在载物玻片与上载器之间使用硅胶密封垫，缓冲载物玻片与上载器的刚性接触，使载物玻片始终处于压力均匀、稳定的状态，大大降低了载物玻片碎裂的风险。

2.2 细胞培养

探究了新型载液观察装置进行长时间细胞培养和细胞观测的可行性。在接入细胞后的0、12、24、36 h时对其中培养的细胞进行观测（见图2）。细胞培养0 h时细胞未完全沉降至载物玻片上，仍有部分细胞悬浮在液体培养基中，此时细胞还未增殖，密度较低，使用显微镜可以清晰地看到细胞已贴附于载物玻片上，呈现出大小均一的球形，形貌正常（见图2（a））；细胞培养12 h后，细胞已经贴壁生长，正常贴壁发育的HeLa细胞呈梭形，图中细胞外形紧凑、形态分明、轮廓清晰，细胞贴壁生长情况良好（见图2（b））；细胞培养24 h后细胞继续增殖，细胞覆盖率达到60%左右，细胞排列紧密，边缘整齐，细胞增殖和生长情况良好（见图2（c））；细胞培养36 h后细胞增殖数量较多，细胞覆盖率达到85%左右，细胞排列紧密，细胞质均匀，生长情况良好（见图2（d））。从以上分析可知，细胞可在本装置中长时间生长，生长状态正常，无染菌情况，同时表明这种新型载液观察装置能够直接使用普通显微镜进行培养细胞的实时观测。

图2 细胞在新型载液观察装置培养

2.3 激光共聚焦显微镜成像实验

与传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜加装了激光扫描装置，逐点扫描荧光标记样品，最后对各点的信息进行总和，从而实现对样品的成像。对本装置内培养的细胞用于激光共聚焦显微镜观测的可行性进行研究。用双氧水处理器件内培养的细胞并且使用Hoechst 33342和PI进行细胞染色。细胞经Hoechst 33342染色后所有细胞核呈蓝色（见图3（a）），经PI染色后部分细胞核呈红色（见图3（b））。染色部分轮廓清晰，说明细胞的蓝色和红色荧光信号可有效通过新型载液观察装置被共聚焦显微镜观测到（20×（NA 0.75）物镜）。从红蓝荧光场合成图（见图3（c））可以看出，蓝色信号区域与红色信号区域重合良号。此外使用40倍和63倍油镜同样可以达到对双荧光信号的有效共聚焦显微镜观测（见图3（d）～（i））。

图3 染色细胞的激光共聚焦显微镜成像图

20×（NA 0.75）物镜的工作距离为0.60 mm；40×（NA 1.3）油镜的工作距离为0.22 mm；63×（NA 1.4）油镜的工作距离为0.19 mm；100×（NA 1.4）油镜的工作距离为0.17 mm［16］。本装置的载物玻片厚度为0.13～0.16 mm，完全能够满足物镜工作距离的要求，使用物镜或油水浸镜都能观测到清晰的图像。

2.4 荧光显微镜成像实验

使用蓝色荧光染料Hoechst33342（1 mg/mL）和红色荧光染料PI（1 mg/mL）对新型载液观察装置内培养16 h的细胞进行染色后，使用普通荧光显微镜进行观测并记录图像（见图4）。Hoechse33342染料可将细胞的细胞核染成蓝色，PI染料可将死亡细胞的细胞核染

成红色。结果表明，使用蓝色荧光染料Hoechst33342和红色荧光染料PI对培养在新型载液观察装置中的细胞进行染色后，能够使用普通荧光显微镜对细胞进行观测，得到清晰的染色细胞蓝场、红场图像。其中蓝色荧光部分为所有细胞核（图4（b））；红色荧光部分表示坏死细胞的细胞核（图4（c））；细胞核位置与明场细胞位置（见图4（a））呈现出一致性。

图4 新型载液观察装置中培养的细胞经Hoechst和PI染色后的图像

Hoechst33342作为常用的蓝色荧光染料，其最大发射波长为460 nm，PI作为常用的红色荧光染料，其发射波长为615 nm，由于装置使用普通盖玻片作为载物玻片，波长范围在460～615 nm之间的光亦可通过，因此本装置适用于多种可见光波段的荧光显微镜观测。

2.5 其他特色

本装置采用的主要材质为玻璃，可以承受高温高压。将装置进行组合后使用蒸汽灭菌锅对新型载液观察装置进行了灭菌实验（见图5）。如图5（a）所示，灭菌前下载器、载物玻片、密封垫、上载器、分离式上盖均无损坏、变形情况。由图5（b）所示，灭菌后下载器、载物玻片、密封垫、上载器、分离式上盖均无损坏、变形情况，装置整体无变化。为了验证新型载液装置能够承载细胞悬液不漏液，将培养基加入到该新型载液装置，由图5（c）可知，新型载液装置经灭菌锅高温高压灭菌后加载细胞悬液后，可以完美承载细胞悬液不漏液。

本装置可重复使用，可以进行批量灭菌，需要进行多次实验时只需增加装置数量即可满足使用需求。本装置使用的载物玻片单价约为0.05元，价格便宜。其余部分的材料由玻璃或硅胶制成，可以反复使用，每次使用的损耗很小可以忽略不计。与单价为10元左右的一次性商业化的细胞培养皿相比，这种新型载液装置单次使用的成本约为培养皿的0.5%。

本装置的一个特色是可以直接装载于面向普通载玻片的载物台支架进行观测（见图6）。载玻片是最普遍的显微镜载物器件，几乎所有的显微镜都设计有能够装载载玻片的支架。本装置的下载器、载物玻片、密封垫、上载器、分离式上盖到组装而成的整个装置都参照载玻片的尺寸设计，为26 mm×76 mm的长方形结构，适应载玻片的载物台支架。且本装置总高12 mm，在激光共聚焦显微镜载物台可容纳的高度范围内。这种面向普通支架设计的器件比起目前市场上商业化的圆柱形培养皿，具有更好的普适性。