辛伐他汀对烟雾暴露大鼠肺血管Toll样受体4表达及肺血管重塑的影响

熊玮 王萍 曾玉兰 周薇 彭红星 周月泉

肺动脉高压是以出现右心衰竭或全心衰竭为特征的严重难治性疾病，而肺血管重塑引起压力性血流受阻是肺动脉高压的重要病理特征，也是其中心环节[1]。吸烟是公认的严重社会危害行为，烟草烟雾中的尼古丁等多种生物碱及含硫化合物不仅可诱发肺癌，引起慢性支气管炎或哮喘急性发作，还可诱发肺血管重塑。Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB信号通路参与血管平滑肌细胞增殖、血管内皮再生及新生血管的形成，在血管重塑中发挥重要作用[2]。他汀类药物广泛用于调脂、稳定动脉斑块等，而其抗炎、抗平滑肌增殖、进而减轻血管周围炎症反应、扩张血管及降低血流阻力等作用近年来也得到广泛关注[3-5]。目前他汀类药物已应用于肺动脉高压的治疗中且初见成效，但他汀类药物影响肺血管重塑的作用机制还需进一步探讨。近年来发现，免疫分子TLR4参与肺血管重塑，本研究通过对烟雾暴露建立的肺血管重塑大鼠模型进行药物干预治疗，观察他汀类药物对TLR4的表达及血管重塑的影响，以期为他汀类药物对肺动脉高压的治疗提供基础实验依据。

材料与方法

1.材料:清洁级健康雄性SD大鼠30只，体质量190～210 g，由华中科技大学同济医学院附属梨园医院老年医学研究所动物实验室饲养。兔抗TLR4多克隆抗体试剂盒购自武汉谷歌生物公司,Trizol试剂盒购自Ambion公司，Mix试剂盒、M-MLV逆转录酶试剂盒均购自Invitrogen公司，β-actin引物由武汉谷歌生物公司合成。奥林巴斯光学显微镜购自日本奥林巴斯公司，实时定量聚合酶链反应(PCR)仪购自日本TOYOBO公司，N2分光光度计购自上海精科，医学图文分析系统型号为HMIAS-2000(武汉千屏影像公司)。

2.方法

(1)实验分组和实验模型制备：将SD大鼠随机分为正常对照组、烟雾暴露组和辛伐他汀干预组,每组各10只。正常对照组大鼠吸入新鲜空气，常规食物喂养。烟雾暴露组和辛伐他汀组大鼠烟雾暴露方法如下：接受烟雾暴露的大鼠在暴露期间，转移于点燃香烟的烟雾暴露箱内，烟雾暴露箱体大小约为105 cm×60 cm×50 cm，香烟每次20支，焦油含量8 mg，用测氧仪监测箱体中的氧浓度(21%左右)，根据氧浓度测量结果来决定通气孔的个数。烟雾暴露组大鼠每天烟雾暴露2次，每次1小时，两次暴露之间至少间隔4小时，暴露时间为8周；辛伐他汀干预组大鼠烟雾暴露方法和时间同烟雾暴露组，且在暴露时间内每日早上9时左右以10 mg/kg辛伐他汀鼻饲灌胃1次。

(2)病理标本制作:3组大鼠均于第8周结束造模，用1%戊巴比妥钠(90 mg/kg)麻醉大鼠后，放血处死，迅速得到病理标本。取右肺动脉冻存于-80 ℃冰箱，备存用于逆转录(RT)-PCR检测；取左主支气管，按常规步骤制成石蜡切片，用于苏木素-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色。

(3)HE染色:在光学显微镜下，观察各组大鼠标本肺血管及肺泡的病理变化情况。严格挑选出厚度约为4 μm的切片进行HE染色，每张切片选取肺血管结构完整且直径为50～200 μm的5支肺血管作为观察对象，采用医学图文分析系统测量血管的内径和外径，计算血管壁厚度、血管壁面积和血管总面积，并计算管壁面积/血管总面积(WA%)、管壁厚度/血管外径(WT%)。

(4)免疫组织化学染色法检测肺动脉TLR4的表达:实验采用PV6000二步法进行免疫组化染色，具体步骤如下：在光学显微镜下观察，选取厚度约4μm的病理切片，用于免疫组化。首先按照常规步骤脱蜡水化，经过酸化、修复，室温孵育后，加入兔抗TLR4多克隆抗体，在4℃环境下过夜，再加DAB显色试剂显色，最后在光学显微镜下观察。每个视野下，随机选取直径约100～200 μm动脉5支，每组随机选取25个视野。后采集图像，并测定每个视野下阳性细胞数量和总细胞数量，用彩色图文分析系统计算出平均积分吸光度值(IA)。肺动脉阳性染色的判断标准：肺动脉壁上出现棕黄色颗粒。

(5)RT-PCR检测肺动脉TLR4 mRNA的表达:取出预留冻存的肺动脉，按照Trizol试剂盒提供的步骤提取各组肺动脉总RNA,取1 μg的RNA逆转录为cDNA(按逆转录试剂盒说明进行操作)，提取1 μl的cDNA用于实验，按试剂盒说明书取吸光度值为1.8～2.0的cDNA用于PCR扩增反应。TLR4上游引物为5’-TATCCAGAGCCGTTGGTGTATCT-3’，下游引物为3’-AATGAAGATGATGCCAGAGCG-5’，扩增长度为85 bp;内参β-actin上游引物为5’-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3’，下游引物为3’-TTGCTGACAATCTCTTGAGGGAG-5’,扩增长度为201 bp。TLR4反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s,60 ℃延伸60 s，40个循环；最后由计算机计算各组Ct值，采用ΔΔCt进行相对定量分析。目的mRNA含量=2-ΔΔCt。

结 果

1.3组大鼠WA%、WT%比较:烟雾暴露组和辛伐他汀组大鼠WA%、WT%明显高于正常对照组，辛伐他汀组大鼠WA%、WT%明显低于烟雾暴露组(P<0.05)，见表1。

2.3组大鼠肺血管典型HE染色结果：正常对照组大鼠肺泡相对完整，肺动脉管腔规则，管壁无明显增厚，血管周围炎性细胞较少；烟雾暴露组大鼠肺泡可见明显融合，肺动脉管壁可见锯齿状改变，管腔变形，血管周围炎性细胞增多；辛伐他汀组大鼠肺泡亦可见融合情况，但较烟雾暴露组减轻，肺动脉壁增厚及管腔变形情况有所改善，血管周围炎性细胞较烟雾暴露组少。见图1。

图1 3组大鼠肺血管HE染色结果(A：正常对照组；B：烟雾暴露组；C：辛伐他汀组；×200)

3.3组大鼠肺动脉TLR4蛋白表达水平比较:烟雾暴露组(0.54±0.09)和辛伐他汀组(0.34±0.07)肺动脉TLR4蛋白表达水平明显高于正常对照组(0.28±0.09)，辛伐他汀组TLR4蛋白表达水平明显低于烟雾暴露组(P<0.05)。

4.3组大鼠肺动脉典型TLR4免疫组化染色结果：正常对照组大鼠肺动脉阳性染色较浅，烟雾暴露组大鼠肺动脉阳性染色明显加深，辛伐他汀组大鼠肺动脉染色程度介于对照和烟雾暴露组之间。见图2。

图2 3组大鼠肺动脉典型TLR4免疫组化染色结果(A：正常对照组；B：烟雾暴露组；C：辛伐他汀组；×200)

5.3组大鼠肺动脉TLR4 mRNA表达水平比较:烟雾暴露组(3.81±0.32)和辛伐他汀组(1.31±0.23)大鼠肺动脉TLR4 mRNA表达水平明显高于正常对照组(1.00±0.12)，辛伐他汀组大鼠肺血管TLR4 mRNA表达水平明显低于烟雾暴露组(P<0.05)。

6.相关分析结果：Pearson相关分析结果显示，TLR4 mRNA与WA%(r=0.888)、WT%(r=0.767)均呈正相关(P<0.05)。

讨 论

肺血管重塑过程也是血管慢性炎症过程，且肺血管重塑广泛参与慢性阻塞性肺疾病(COPD)、特发性肺间质纤维化(ITP)及其他慢性肺部炎症性疾病的病程[6]。TLR4是体内重要的免疫分子，在免疫反应、炎症损伤、脂质代谢之间发挥纽带作用，TLR4活化后在血管慢性炎症方面发挥重要作用，且TLR4/NF-κB信号通路参与肺血管增生或新生及冠状动脉硬化等血管性疾病的重要环节[7-8]。前期实验结果已证实烟雾暴露会影响TLR4的表达，且TLR4的表达与肺血管重塑相关，具体机制可能与TLR4/NF-κB信号通路活化后炎症因子释放增强，进而诱导血管平滑肌增生有关[9]。广泛用于降脂、调脂稳定斑块的羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂除具有调脂作用外，在抗炎、抗血管增殖、诱导血管平滑肌凋亡等方面发挥重要作用[10]，已被用于肺动脉高压及动脉硬化的防治。辛伐他汀是第一代HMG-CoA还原酶抑制剂的代表药物，且已有用于肺动脉高压治疗的实例。尽管如此，辛伐他汀在肺动脉高压的治疗中仍处于初级阶段，对肺血管重塑的药理机制还不甚明确。因此本实验通过对烟雾暴露后发生肺血管重塑的大鼠模型加以辛伐他汀干预，观察其对血管的保护作用，并初步探讨其与近年来发现的TLR4是否关联。

缺氧缺血、大气污染、细菌或病毒感染等均可诱发肺血管炎症改变。本实验通过烟雾暴露制备肺血管炎症损伤模型，对大鼠口服辛伐他汀干预治疗，观察其肺血管重塑改变。2003年Nishimura等[11]提出他汀类药物可通过抗炎机制在减轻血管重塑中发挥作用；2011年陈丹丹等[12]对比格犬进行实验证实他汀类药物通过抑制比格犬白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子等炎症因子的释放减轻血管重塑，改善肺动脉高压，而本次实验结果发现，辛伐他汀干预治疗后，大鼠肺血管管壁增厚及变形情况有所减轻，且在光镜下观察发现血管周围炎症细胞数量明显减少，提示辛伐他汀对血管重塑有改善作用，且可能与减少炎症细胞浸润有关。本实验结果与上述研究结果一致，证实辛伐他汀在烟雾暴露大鼠肺血管重塑治疗中，发挥了一定作用。

他汀类药物在干预血管炎症方面的作用已成为研究热点。目前已有动物实验结果证实他汀类药物对TLR4有调节作用。许旭光等[13]通过对大鼠鼻饲辛伐他汀后，检测到TLR4蛋白表达水平受到抑制，大鼠动脉硬化程度减轻，且TLR4蛋白表达水平与辛伐他汀的浓度有关，其机制可能与辛伐他汀抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)-TLR4信号通路，从而引起下游的肿瘤坏死因子等释放减少有关；李悦妍等[14]通过动物实验证实阿托伐他汀能够改善动脉粥样硬化程度，可能与下调TLR4表达引起单核细胞趋化蛋白(MCP-1)和转化生长因子β1(TGF-β1)等炎性因子的表达有关，且TLR4蛋白表达水平与他汀类药物的剂量有关。本研究发现，经辛伐他汀干预后，大鼠肺血管形态有改善，且周围的炎症渗出减轻，检测到TLR4蛋白表达水平下降，PCR结果证实TLR4 mRNA表达水平在辛伐他汀干预后明显下降，与血管重塑程度呈正相关，初步提示辛伐他汀有抑制TLR4蛋白表达、减轻炎症反应的作用。而我们前期实验结果证实，TLR4/NF-κB参与血管平滑肌增殖，诱导血管重塑，因此初步推测辛伐他汀对血管重塑的改善作用可能与TLR4/NF-κB活化被抑制、炎症反应被有效减轻有关。

综上所述，辛伐他汀在烟雾暴露后的大鼠肺血管重塑中能够有效改善血管炎症反应，减轻血管重塑，其机制可能与引起TLR4蛋白表达水平下降有关。而辛伐他汀影响TLR4下游哪些炎症因子的表达及是否还有其他的作用途径还需进一步研究证实。