超声波对绿豆种子生长发育的影响

闫延鹏， 郑 杰， 张雪梅， 陈 宇， 李鸿淋， 崔建国，2

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054；2.重庆理工大学 药物化学与分子药理学重庆市重点实验室, 重庆 400054)

超声波是一种音调高于人类听觉的声音，频率超过20 kHz，在众多领域具有广泛的应用。低频超声作为快速增强各种生物活性的方法，在过去的十年中得到了越来越多的关注，通过改变超声参数，可以达到不同的物理、化学和生物效果，从而实现对目标细胞活性增强的目的[1]。低频超声波作用于生物体，具有多种生物效应，其中最主要的有机械效应、空化效应和热效应[2]。已有研究表明，超声可以通过多种途径加速细胞生长，如升高细胞pH值[3-4]或Ca2+浓度[5-6]，改变细胞膜的通透性[7-8]等。

超声技术在植物研究和农业生产中具有广阔的应用前景。最早从Willian等[9]用超声处理玉米种子使其产量增加35%，到后期关于黄精种子[10]、梭梭种子[11]和横经席种子[12]等各种植物，研究者们都进行了大量的研究工作。但目前超声对植物种子影响的研究大多缺少理论基础，参数选择存在一定的随机性和盲目性，更多的是以实验测试来探究超声对种子生长的影响。

针对上述情况，从基础理论出发研究超声波对绿豆种子发芽率的影响，通过理论和频率仿真得到了绿豆细胞的特征频率，然后设计了一种超声刺激装置，该装置可以对刺激环境进行检测和控制，并且能够及时调节超声作用参数。利用该装置分别研究了超声频率、刺激时间和正弦波信号激励电压对绿豆种子发芽指数的影响，在此基础上研究了连续波和脉冲波超声对绿豆发芽的影响，并创新性的提出了超声协同低浓度氯化钠对绿豆发芽影响的研究。

1 矩形细胞膜共振理论

绿豆种子多为矩形细胞[13]，设矩形细胞膜的长和宽分别为a和b，则细胞膜的振动值为[14]:

(1)

其中，Z为膜的位移，c为振动传播速度，F(x，y，t)为矩形膜遭受的外力。根据初始条件和边界条件[15]，薄膜势能增量为：

(2)

动能表达式为：

(3)

(4)

设

(5)

(6)

其中，M为细胞膜单位面积的重量，T为细胞膜平均表面张力，所以

(7)

其中,σ为薄膜的表面密度。当振频指标m=n=1时，细胞膜的基本特征频率为：

(8)

2 矩形细胞特征频率的仿真

使用COMSOL Multiphysics 5.4有限元仿真软件对矩形细胞特征频率进行了仿真。细胞膜主要由蛋白质、磷脂和碳水化合物组成，为了简易化仿真，本文将绿豆种子细胞等同于均匀的长方体，根据各组分的平均密度，求解均值得到细胞膜的平均密度为1 080 kg·m-3，矩形细胞模型相关参数如表1所示[16-17]。

表1 细胞膜仿真材料参数

当细胞膜的泊松比为0.25，杨氏模量为400 Pa时，通过仿真计算可知，矩形细胞模型最小特征频率为41.202 kHz，为了简化仿真过程，超声高次谐波产生的其余特征频率暂时不予考虑。该特征频率下的细胞模型振型如图1所示，由于矩形的对称性，图1中的振型呈现对称分布。

3 超声刺激对绿豆生长的影响

3.1 超声细胞刺激系统

超声细胞刺激系统共包括冷却箱、水浴箱控制装置和超声刺激驱动装置三部分。冷却箱主要是通过半导体制冷片进行冷却箱内部循环水的降温。超声刺激驱动装置主要包括信号发生器(北京普源RIGOL DG 1012)，ATA-10功率放大器(西安安泰电子科技有限公司，内部包括阻抗匹配器，机箱尺寸为260 mm×160 mm×60 mm)。

水浴箱控制装置主要包括水浴槽、培养皿、显示单元、压电陶瓷超声换能器(非聚焦型48 kHz、65 kHz和85 kHz)、温度控制检测单元、循环水控制单元以及中央控制单元等部分。绿豆种子最适生长温度约为25 ℃，为了得到良好的刺激环境，本装置通过DS 18 B 20温度传感器实时进行水温检测，温度偏低时通过加热片给予水温补偿，当水温超过25 ℃时通过循环水控制单元和冷却箱对水浴槽进行降温。超声换能器以阵列形式固定于水浴槽的底部背面，可以通过控制装置对相应频率的换能器进行选择性激励，因换能器在工作时会引起其正上方水槽底部水温升高(当水浴箱循环水关闭时，约升温1.0 ℃)可能会影响该位置处细胞的生长，如图2所示，通过循环水控制单元驱动水泵均匀水浴槽内的水温，并可起到一定的降温作用。由于培养皿处于换能器上方10 mm左右处，经测得该处水温升高不足0.2 ℃，故忽略水温对绿豆生长的影响。

超声细胞刺激系统如图3所示。由信号发生器产生与换能器频率匹配的具有特定激励电压的正弦信号，该信号传输到功率放大器(功率放大器增益×10,输出阻抗为1Ω)产生实验所需的超声电功率，并最终驱动换能器产生超声波作用于绿豆种子。

3.2 材料与方法

1)材料：市售新鲜绿豆种子。

2)前期准备：挑选实验所需数量形态饱满的绿豆种子，将绿豆种子用去离子水清洗两次，并置于清水中浸泡3 h。使用清水浸泡绿豆可以提高种子含水量，解除休眠状态，利于种子萌发，也可以增加种子内胶体的亲水性，提高原生质的粘滞性。

3)实验步骤：将每组(30个)绿豆置于培养皿中，分别放入水浴槽内并固定于对应换能器的上方10 mm左右处，调整好实验参数，最后对绿豆进行规定时长的超声刺激。

4)后期处理：将超声刺激后的实验组和空白超声刺激的对照组绿豆种子在同一条件下统一培养。以12 h为一个周期统计发芽的绿豆数目，以芽长达到种子总长的一半为发芽标准。每组评判指标为种子发芽率和发芽指数[18]：

(9)

本实验以第一周期种子的发芽个数进行分析，以下统称第一周期发芽率为初始发芽率。

(10)

其中，GI为发芽指数，Dt为发芽周期，Gt为一个周期内发芽的种子个数。

3.3 超声频率对绿豆生长的影响

在相同刺激时间和正弦波信号激励电压下，分别用频率为48 kHz、65 kHz和85 kHz的超声波换能器产生超声作用于绿豆种子。挑选4组浸泡后的饱满绿豆种子，每组种子为30颗，空白超声刺激组作为无超声作用的空白对照组(ck)，超声频率分别为48 kHz、65 kHz和85 kHz的刺激组作为实验组，每组刺激时间为35 min，信号激励电压为10 Vpp。每组实验重复3次，统计3次实验数据取平均值，如表2所示。依据表2数据得到经48 h(4个周期)后种子的发芽指数和初始发芽率(图4)。

根据表2和图4可知，实验组种子的发芽率和发芽指数均高于对照组，表明超声刺激对种子的生长活性和速度具有一定的促进作用。频率为48 kHz时种子的发芽率和发芽指数均高于其余各实验组，表明48 kHz超声频率相较于其他频率更能够使细胞实现共振，从而促进种子生长，与仿真所得的矩形细胞特征频率基本一致。

表2 不同超声频率下种子的发芽率和发芽指数

3.4 刺激时间对绿豆生长的影响

挑选6组绿豆种子，每组30颗，对照组(ck)施加空白超声刺激，超声刺激时间分别为25 min、30 min、35 min、40 min和45 min的刺激组作为实验组，各组超声频率为48 kHz，正弦波信号激励电压为10 Vpp，每组实验重复3次，统计3次实验数据取平均值，如表3所示。依据表3数据得到经48 h(4个周期)后种子的发芽指数和初始发芽率(图5)。

表3 不同刺激时间下种子的发芽率和发芽指数

由表3和图5可知，当以最佳超声频率和一定信号激励电压刺激绿豆种子时，种子的初始发芽率和发芽指数随刺激时间的增加先升高后降低，在35 min时均达到最大。ck组、25 min组和45 min组的发芽指数差别不大，表明刺激时间较短对细胞活性影响不明显，而时间过长则不利于细胞生长。刺激时间为45 min时尽管发芽指数和ck组相一致，但初始发芽率有所下降，表明过度的超声刺激会降低细胞活性，对种子的初期萌发速度产生抑制作用。

3.5 信号激励电压对绿豆生长的影响

挑选4组绿豆种子，每组30颗，ck组给予空白超声刺激，正弦波信号激励电压分别为5 Vpp、10 Vpp和15 Vpp的刺激组作为实验组，各组超声频率为48 kHz，刺激时间为35 min，每组实验重复3次，统计3次实验数据取平均值，如表4所示。依据表4数据得到经48 h(4个周期)后种子的发芽指数和初始发芽率(图6)。

表4 不同信号激励电压下种子的发芽率和发芽指数

由表4和图6的实验结果可知，在最佳超声频率和刺激时间条件下，实验组绿豆发芽率和发芽指数均高于ck组，而5 Vpp组与ck组的发芽指数较为接近，表明超声强度过低时不能对种子萌发产生明显影响。当信号激励电压为10 Vpp时绿豆发芽指数最大，而当超声强度过大时绿豆生长速度有所降低。通过上述实验可知，超声刺激绿豆的最佳参数是超声频率为48 kHz，刺激时间为35 min，信号激励电压为10 Vpp，后续实验均在此条件下进行。

3.6 不同信号波形对绿豆生长的影响

挑选8组绿豆种子，每组30颗，其中一组为对照组给予空白超声刺激，标记为ck，其余7组分别施加正弦信号、方波信号、三角波信号和不同占空比(20%、40%、60%和80%)的脉冲超声信号。每组实验重复3次，统计3次实验数据取平均值，如表5所示。依据表5数据得到经48 h(4个周期)后种子的发芽指数和初始发芽率(图7)。

由表5和图7可知，不同波形条件下，经超声刺激的实验组初始发芽率和发芽指数均高于ck组，其中占空比为20%的脉冲信号绿豆发芽率最高，且高于ck组22%，表明脉冲波信号优于连续波信号，而且不同波形的连续信号实验结果没有明显差异。随着脉冲信号占空比的升高，发芽率逐渐下降，表明强度过大的超声脉冲信号会对绿豆细胞生长产生一定程度的抑制，减缓其发芽速度，但积极影响高于消极影响。

表5 不同信号波形下种子的发芽率和发芽指数

3.7 不同NaCl盐浓度下超声刺激对绿豆生长的影响

根据文献报道[19]，植物种子的萌发会随着盐浓度的升高而降低，究其原因是因为离子的毒害作用。针对上述情况，本文创新性的选用低浓度NaCl溶液研究绿豆的萌发情况。挑选9组绿豆种子，每组30颗，其中一组为对照组，其余8组为实验组分别代表4种不同盐浓度下(8.55 mmol·L-1、17.09 mmol·L-1、51.27 mmol·L-1和85.45 mmol·L-1)是否伴有超声协同作用的情况，其中有超声组标记为“盐浓度+U”。每组实验重复3次，统计3次实验数据取平均值，如表6所示。依据表6数据得到经48 h(4个周期)后种子的发芽指数和初始发芽率(图8)。

表6 不同NaCl盐浓度下种子的发芽率和发芽指数

由表6和图8可知，低浓度(8.55 mmol·L-1和17.09 mmol·L-1)盐溶液对绿豆生长有一定的促进作用，当盐溶液浓度过高，则会由于盐胁迫的影响使绿豆发芽速度减慢并远低于正常水平。实验表明，当超声与盐溶液协同作用时，绿豆种子生长速度高于单一的盐溶液条件，提高了种子的发芽率。当盐浓度为8.55 mmol·L-1时，有无超声刺激对绿豆生长影响不大，这可能是因为绿豆种子适应较低浓度盐溶液，可以实现正常的离子交换而无需外力作用，当盐浓度为17.09 mmol·L-1时，在超声的协同作用下可以极大地促进绿豆发芽，并高于ck组41%。同样，由于盐胁迫的存在，即使给予超声刺激，高浓度盐溶液下种子发芽率会有所下降，虽然发芽率高于ck组，但长势(种子根长)明显较差。

综上所述，在超声刺激细胞的过程中，适当的超声参数能使细胞最大限度产生共振，经超声处理的种子表面呈现出许多小孔[19]，结合超声的机械作用从而改变细胞膜通透性，促进细胞生长与增殖，提高种子的发芽速度与发芽率。

4 结 论

通过建立绿豆种子矩形细胞模型对其特征频率进行理论分析，并通过有限元仿真得到细胞特征频率，从而确定超声频率的选择范围。根据实验需要自行设计了一种超声刺激装置，该装置采用的超声换能器以阵列形式固定于水浴槽底部背面，可实现水温的检测与控制、水流量调节以及超声换能器频率选择等功能，该装置集多功能于一体，操作简单，使用便捷。

使用自制装置对绿豆种子进行超声刺激实验，分别研究了超声频率、刺激时间和信号激励电压对绿豆发芽的影响，并在此基础上研究了连续波和脉冲波超声以及超声协同不同浓度的氯化钠对绿豆发芽的影响。实验结果表明，在适当的超声频率范围内，刺激时间不足或信号激励电压过低不能对种子产生明显影响，当实验参数超出一定范围则会对种子初期生长速度产生抑制作用。通过多次实验得到绿豆发芽的最优方案为当脉冲波占空比为20%时，在48 kHz、35 min、10 Vpp条件下绿豆发芽率最高，最佳频率与仿真计算所得的矩形细胞特征频率(41.202 kHz)基本一致，而且体积摩尔浓度为17.09 mmol·L-1的NaCl协同超声处理可以极大地加速绿豆发芽。对于陈年种子来说，由于储存时间过长导致种子活力损失，发芽率大幅下降，不利于后期的培育。因此，本研究提供了一种新的思路，通过超声与低浓度的NaCl溶液协同作用，以实现种子的高发芽率。