生态环境和打顶对烟叶烟碱含量杂种优势的影响

田宗林， 喻奇伟， 姜超英， 郑登峰， 熊 晶， 滕建辉，陈 倩， 罗 雯， 莫泽君， 段丽丽， 刘仁祥

(1.贵州大学烟草学院，贵州省烟草品质研究重点实验室， 贵阳 550025；2.贵州省烟草公司毕节市公司， 贵州 毕节 551700；3.贵州省烟草公司， 贵阳 550001)

杂种优势是生物界的一种普通现象，杂种优势利用也是提高作物产量和品质的一种重要育种方法，在水稻、玉米、小麦、棉花、油料等作物生产上已经得到了广泛的应用，特别是水稻和玉米杂交种的大面积利用对我国乃至世界粮食增产和安全作出了巨大贡献[1]。杂种优势是指两个遗传性不同的亲本杂交产生的杂种后代在生长势、生活力、繁殖力、适应性以及产量、品质等性状方面超过其双亲的现象[2-3]。中亲优势、超亲优势和超标优势等杂种优势度量指标，从不同层面反映了杂种优势的强弱，因此，根据研究杂种优势的目标，科学设计相应的试验并采用合理的度量指标是提高杂种优势研究效率的关键。在杂交种选育过程中，育种工作者往往将杂交组合安排在生态环境差异大的点，并采用当地最佳的生产技术措施进行多点试验，测定超标优势及超亲优势以鉴定杂交组合的利用潜力。目前，未见有关不同生态环境、不同栽培措施对杂种优势是否有影响的研究报道，研究者往往根据杂交种选育的试验方法就认为不同生态环境、不同栽培措施对杂种优势有影响，在测定中亲优势的杂种优势遗传及形成机制研究中，也将F1及其亲本安排在不同试验点，并采用不同的栽培措施进行试验，导致人力物力的投入大、研究效率不高。

烟草是生物学机制研究的理想模式植物。烟碱是在烟草的根部合成、通过木质部运输到叶片的液泡中积累的一种长距离运输次生代谢物，是衡量烟叶质量的一个重要因素[4-5]，其合成代谢过程十分复杂。烟碱具有显著的杂种优势[6-7]，利用杂种优势调控烟碱，对于烟草育种和烟碱生产均具有重要的实践意义[8-9]。前期利用烟草根转录组分析揭示了超显性在烟叶烟碱杂种优势形成中的关键作用，发现N-甲基转移酶(PMT)、天冬氨酸氧化酶(AO)、喹啉合酶(QS)等参与烟碱合成和烟碱转运相关基因在杂交种根部表达水平显著上调，证实了杂交种具有更高的烟碱合成效率是烟碱杂种优势形成的主要原因之一[10]。为此，本研究以3个组合及其亲本为研究对象，设置不同生态环境、打顶和不打顶处理，测定不同处理烟叶烟碱含量、烟叶烟碱含量杂种优势值，以及与烟碱杂种优势相关的PMT、AO、QS基因的相对表达量，探讨生态环境和打顶措施对烟碱含量杂种优势的影响，以期为提高作物杂种优势研究利用效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 参试材料

在前期研究基础上，选择杂种优势差异较大的Va 116×巴斯马、Va 116×GDH 88、K 326×青梗等3个组合，及其亲本K 326、Va 116、GDH 88、青梗、巴斯马为试验材料。所有材料均由贵州烟草品质研究重点实验室提供。

1.2 田间试验方法

1.2.1试验点设置

为了尽可能扩大试验点的差异，试验于2019—2020年分别在贵州大学烟草科研基地、威宁县烟草科技园、德江县烟草科技园进行。贵州大学烟草科研基地位于西秀区杨武乡，26.055 433 1°N，106.158 200 2°E，海拔1 250 m；威宁县烟草科技园位于贵州省威宁县黑石头镇，26.745 244 1°N，104.017 612 3°E，海拔2 200 m；德江县烟草科技园位于德江县煎茶镇，28.267 264 9°N，108.116 321 1°E，海拔600 m。选择基地内最具代表性的地块作为试验地。

1.2.2田间试验设计

各试验点均采用随机区组设计，2次重复，每个小区种植4行，每行种植15株，行株距为110 cm×55 cm。每个地区实验地的重复实验区周边设置两行保护行，每行第一株和最后一株不参与取样。除试验设置的打顶及不打顶处理外，其施肥、密度等所有生产技术和管理措施均按照当地优质烟叶生产技术方案执行。

1.2.3打顶处理的方法

在威宁试验点设置打顶和不打顶处理，其余试验点均打顶。打顶采取50%试验材料的中心花开放50%时，同一天打顶，所有处理的留叶数均为18片。

1.3 测定项目及方法

1.3.1取样方法

取样在烟碱杂种优势表现最大的打顶当天和打顶后7天两个时期进行[7,11]。取样时，每一小区随机选择3株，取中部9～11叶位叶片，于105 ℃下杀青30 min，然后在75 ℃下烘干后用于烟碱含量测定。在取烟碱测定样品的同时，取植株幼嫩的根器官等量混合，保存于-86 ℃超低温冰箱中，用于相关基因表达量的测定。

1.3.2烟碱的测定方法

采用《烟叶化学》中的“紫外分光光度计法”进行烟碱含量测定[12]。

1.3.3相关基因表达量的测定

1)样品总RNA提取与cDNA合成

参照OMIGA E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol II(for difficult samples)提取总RNA，cDNA合成的20 μL反应体系按试剂盒说明书(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，ABI)进行。

2)引物设计

选择PMT、AO、QS3个基因，在NCBI上查找目的基因的序列，根据荧光定量PCR引物设计原则，利用Primer Premier 5.0软件和Beacon Disgner软件，设计目的基因的引物，引物序列详见表1。引物由北京擎科生物技术有限公司合成。

表1 Real-time PCR检测基因的引物序列

3)实时荧光定量 PCR分析

用Talent qPCR PreMix(SYBR Green)试剂盒进行基因表达量测定。用比较阈值法公式进行计算，并用Excel软件和Origin软件处理分析数据。

1.4 统计分析方法

实验数据以小区为单位，进行烟碱含量、烟碱杂种优势值、烟碱杂种优势相关基因相对表达量的数据进行统计分析。采用Excel 2013软件和DPS 14.10统计软件对相关数据进行统计分析。

1.4.1杂种优势的计算方法

中亲优势=[(F1-MP)/MP]×100%；

超亲优势=[(F1-HP)/HP]×100%；

超标优势=[(F1-ck)/ck]×100%。

式中：MP为双亲平均值；HP为高亲值；F1为杂种一代的数值；ck为K 326。

1.4.2烟碱杂种优势相关基因相对表达量的计算方法

采用王秀莉等[13]的比较阈值法对强、弱优势代表材料中相关基因的Real-time PCR测定结果进行相对定量分析，根据测定的Ct值，计算各杂交种及双亲中的基因相对表达量值。然后计算各基因的中亲表达优势后，再与烟碱含量的杂种优势进行相关分析。

2 结果与分析

2.1 生态环境和打顶对烟叶烟碱含量的影响

2.1.1生态环境对烟叶烟碱含量的影响

由不同品种在不同环境处理下的烟碱含量结果(表2)看出，3个试验点间的烟叶烟碱含量差异显著，德江试验点的烟叶烟碱含量最高、威宁点次之，杨武点最低；说明环境对烟叶烟碱含量有明显的影响。不同品种间烟叶烟碱含量也存在差异，青梗的烟叶烟碱含量最高，为1.233 6%；Va116的烟叶烟碱含量最低，为0.518 1%。表明本研究选用的生态试验点和参试材料有较强的代表性。

表2 参试材料在不同环境下的烟碱含量

2.1.2打顶对烟叶烟碱含量的影响

打顶是烟叶生产中的一项重要的农艺措施。由表3可看出，打顶处理7 d后，烟叶烟碱含量高于不打顶处理，打顶和不打顶处理间差异达显著水平，说明打顶对烟叶烟碱含量有明显调控作用，表明本研究选用打顶和不打顶处理代表农艺措施进行比较有较强的代表性。

表3 参试材料打顶和不打顶的烟碱含量

2.2 生态环境和打顶对烟碱含量杂种优势的影响

2.2.1生态环境对烟碱含量杂种优势的影响

由表4可看出，同一杂交组合烟叶烟碱含量的中亲优势在3个试验点间的差异均不显著，3个组合中亲优势平均值在3个试验点间的差异也不显著；同一杂交组合烟叶烟碱含量的超亲优势、超标优势值在3个试验点间的差异达到显著，3个组合超亲优势、超标优势平均值在3个试验点间的差异也达到显著。结果表明，在杂种优势研究利用中，因杂种优势度量指标的不同，对杂交种优势的评价结果也不同；同一杂交组合中亲优势值不因试验地点的改变而产生明显的变化，而超亲优势值、超标优势值因试验地点的改变而产生了明显差异。

表4 不同生态环境下3个杂交组合的烟碱含量杂种优势

2.2.2打顶对烟碱含量杂种优势的影响

由表5可看出，同一杂交组合烟叶烟碱含量的中亲优势在打顶和不打顶处理间的差异均不显著，3个组合中亲优势平均值在打顶和不打顶处理间的差异也不显著；而超亲优势、超标优势值在不同杂交组合间及打顶和不打顶处理间的差异达到显著。结果表明，在杂种优势研究利用中，因杂种优势度量指标的不同，对杂交种优势评价的结果也不同；同一杂交组合中亲优势值不因农艺措施的改变而产生明显的变化，而超亲优势值、超标优势值因农艺措施的不同产生了明显差异。

表5 打顶与不打顶措施下3个杂交组合的烟碱含量杂种优势

2.3 生态环境和打顶对烟碱杂种优势相关基因表达量的影响

2.3.1生态环境对烟碱杂种优势相关基因表达量的影响

生物的性状调控是由基因和环境共同控制蛋白酶合成来实现的，由表6可知，同一组合同一基因的表达量中亲表达优势在不同试验点间的差异不显著，3个试验点间3个组合烟叶烟碱含量杂种优势相关基因表达量中亲表达优势的平均值的差异也不显著。说明生态环境对烟叶烟碱含量杂种优势相关基因表达量的中亲表达优势没有明显的影响，研究结果从基因表达水平上证明了不同生态环境对烟叶烟碱含量中亲优势没有显著影响这一研究结果的可靠性。

表6 不同生态环境下的烟碱杂种优势相关基因的中亲表达优势

2.3.2打顶对烟碱杂种优势相关基因表达量的影响

由表7可看出，打顶处理7 d后，打顶和不打顶处理间同一组合同一基因的表达量的中亲表达优势差异不显著，打顶和不打顶处理间3个组合烟叶烟碱含量杂种优势相关基因表达量中亲表达优势平均值的差异也不显著。说明打顶处理对烟叶烟碱含量杂种优势相关基因表达量中亲表达优势没有明显的影响，研究结果从基因表达水平上证明了打顶措施对烟叶烟碱含量中亲优势没有显著影响这一研究结果的可靠性。

表7 打顶与不打顶措施下的相关基因的中亲表达优势

3 讨 论

烟碱是在烟草的根部合成[14]、通过木质部运输到叶片的液泡中积累[15]的长距离运输次生代谢物，占烟草生物碱总含量的90%～95%[16]，是烟草商业性使用的物质基础[17]。此外，烟碱在医药、化工、病虫生物防治领域也有广泛应用。研究表明，烟叶中烟碱含量受土壤氮、磷、钾营养元素以及土壤pH值、质地、温、光、水、海拨高度等生态环境的影响较大[18-21]，施氮量对烟草生长和烟碱的积累影响最大[22]，对烟碱积累的调节作用超过其他营养元素，且与烟碱的含量呈正相关关系[23]；烟叶烟碱含量与成熟期积温和日照时数呈正相关，与降雨量呈负相关，其中日照时数对烟碱含量的影响最大[24]。打顶是烟草栽培中的重要农艺措施，对烟叶烟碱含量的影响很大[25-26]，烟株合成烟碱的能力在打顶前后发生了极大的变化，打顶可加速烟草株体内烟碱的合成[27]，提高烟叶烟碱含量；早打顶且抹去腋芽的烟株烟叶烟碱含量高，烟叶品质差[28]。本研究结果表明，生态环境和打顶措施对烟叶烟碱含量有明显的影响，烟叶生产中烟碱含量的调控措施要因烟区环境而异，打顶也是调控烟叶烟碱含量的重要措施。

杂种优势是生物界的一种普通现象，杂种优势利用也是提高作物产量和品质的一种重要育种方法，在水稻、玉米、小麦、棉花、油料等作物生产上已经得到了广泛的应用[3]。杂种优势的强弱可以通过测算配合力来估计，而较为普遍的方法是直接采用中亲优势、超亲优势和超标优势从不同层面度量杂种优势强弱。中亲优势表示杂种F1中能固定遗传的部分，用于杂种优势遗传理论研究；超亲优势是杂种F1在生产上利用的前提，直接反映了杂交组合的利用潜力；超标优势是衡量杂种F1生产利用价值最直接的指标。本研究结果表明，不同生态环境、打顶与不打顶处理间烟叶烟碱含量的中亲优势值差异不显著，而超亲优势值、超标优势值差异显著，表明在杂种优势研究中，根据研究目标选择合理的杂种优势度量指标，对于提高杂种优势研究利用效率尤为重要。在杂交种利用价值评价为目标的研究中，应将杂交组合安排在生态环境差异大，并采用当地最佳的生产技术措施进行多点试验，测定超亲优势或超标优势即可度量杂种F1的生产利用价值，各种作物多年多点品种区域试验的理论依据亦在于此。在以解析杂种优势遗传调控机理为目标的研究中，只需将杂种F1及其双亲在相同条件下种植，测定中亲优势即可评价杂种优势的强弱，可大幅度减少人力物力的投入，提高研究效率。

生物的性状调控是由基因和环境共同控制蛋白酶的合成来实现，其表达量与数量性状表现值有关。本研究在前期研究的基础上，测定不同生态环境、打顶和不打顶处理下烟叶烟碱含量杂种优势相关基因PMT、AO、QS的相对表达量，基因表达量的中亲表达优势统计结果显示，不同试验点、打顶与不打顶处理间烟叶烟碱含量杂种优势相关基因表达量的中亲表达优势值差异不显著，结果从基因表达水平上证实了生态环境、打顶处理对烟叶烟碱含量的中亲优势无显著影响这一研究结果的可靠性。

4 结 论

生态环境和打顶对烟叶烟碱含量的中亲优势值没有显著的影响，在以解析杂种优势遗传调控机理为目标的研究中，可以不考虑生态环境和打顶的影响，在同一试验点对双亲及F1采用相同的农艺措施就能获得较为准确的杂种优势鉴定结果，研究结果为降低杂种优势研究的投入、提高研究效率提供了理论依据。本研究虽然进行了2年3个点的试验，但为了避免田间试验规模过大对试验结果的准确性造成负面影响，只选择了杂种优势差别较大的3个杂种F1及其5个亲本为材料；同时，本研究仅以烟叶烟碱含量性状的杂种优势为研究对象，其他作物或其它性状的杂种优势是否具有同样的规律，还有待更多的研究者做进一步的验证。