环境胁迫及胁迫解除对不同来源雪上一枝蒿种子萌发的影响

刘维暐， 赵丽伟， 黄 华， 明升平， 范中玉，李 金， 陈小灵， 和晓芬， 许 琨

(1.中国科学院昆明植物研究所丽江高山植物园， 云南 丽江 674100；2.丽江市玉龙纳西族自治县科学技术局， 云南 丽江 674100；3.丽江市玉龙纳西族自治县种子管理站， 云南 丽江 674100)

雪上一枝蒿(Aconitumbrachypodum)为毛茛科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum)多年生草本植物，别名一支蒿、铁棒锤、铁牛七、三转半等[1-2]。主要分布在云南东北部和西北部的东川、会泽、宣威、昭通、巧家、宁蒗、永胜、大理、丽江、香格里拉等地[3]，野生于海拔3 100～4 300 m的高山草地、多石砾山坡或疏林下。雪上一枝蒿是云南、四川民间广为流传和使用的跌打、疗伤的止痛药[4]，被用于治疗风寒湿痹所致的筋骨和关节疼痛、跌打损伤所致的瘀血疼痛及虫蛇咬伤等症[5]。

雪上一枝蒿中的化学成分主要为二萜生物碱类[6-8]，以其为原料开发了雪上一支蒿总碱片剂、注射剂、骨痛灵酊以及搽剂、气雾剂等制剂[9]。由于应用广泛且野生资源相对匮乏，在云南丽江、曲靖，甘肃甘南等地，已开展了雪上一枝蒿的规模化种植工作[10-11]。尽管通过组织培养、根状茎切块也可以对雪上一枝蒿进行繁育[12]，但因雪上一枝蒿种子获取较易，采收量较大，栽培种植基地主要采取种子撒播的方式对其进行繁育。

目前，雪上一枝蒿种植区域相对较广，在我国多个省份均有人工栽培，但由于各地采收种子质量良莠不齐，成熟度不一致[13]，播种管理粗放，栽培基地土壤基质各异，导致雪上一枝蒿在实际生产过程中成苗量较低[14]。本实验以不同来源地雪上一枝蒿种子为研究对象，研究不同环境条件对雪上一枝蒿种子萌发的影响，并探索胁迫条件下其种子的萌发特性及胁迫条件解除后种子恢复萌发的特征，以指导实际播种种植，从而缓解其野生资源不断减少与市场需求不断增加的矛盾。

1 材料与方法

1.1 实验材料

于2019年9—10月，采集甘肃省甘南藏族自治州舟曲县、云南省丽江市玉龙纳西族自治县野生雪上一枝蒿种子作为实验材料。

1.2 实验方法

1.2.1种子活力检测

选取成熟饱满，无病虫害的雪上一枝蒿种子，按不同来源分组，每组选择20粒，重复3次，沿种胚纵切后，分别置于蒸馏水(对照)及2%的氯化三苯四氮唑(TTC)染液中进行避光染色，20 min后将种子取出镜检，观察染色情况并统计种子活力。

1.2.2环境胁迫对雪上一枝蒿种子萌发的影响

将采集的雪上一枝蒿种子，每150粒为一组，每组3个重复，每个重复50粒，置于铺设有灭菌滤纸，并用蒸馏水充分浸润的培养皿中。培养皿外侧用塑料保鲜膜包裹，防止内部溶液挥发带来浓度及pH值变化的影响。经不同胁迫条件处理后，于光照培养箱中培养，待萌发终止后统计萌发时间及萌发率。

具体胁迫条件包括：

1)温度胁迫。设置10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃温度梯度，观察温度对雪上一枝蒿种子萌发的影响；

2)酸碱度胁迫。设置pH值范围为5.0～8.5，每0.5设置一个梯度，共8个pH梯度值溶液，在20 ℃恒温条件下培养，观察环境pH值对雪上一枝蒿种子萌发的影响；

3)盐分胁迫。配置NaCl水溶液，按质量分数0.1%、0.5%、1%、5%设置浓度梯度，以蒸馏水作为对照，在20 ℃恒温条件下培养，观察盐分胁迫对雪上一枝蒿种子萌发的影响。

1.2.3解除环境胁迫后雪上一枝蒿种子恢复萌发情况

1)解除温度胁迫后雪上一枝蒿种子恢复萌发情况。

将低温(10 ℃)及高温(30 ℃)条件下20 d后，取出未萌发的种子，置于铺有灭菌滤纸，并用蒸馏水充分浸润的培养皿中，于光照培养箱中20 ℃恒温培养，观察记录雪上一枝蒿种子恢复萌发的情况。

2)解除盐分胁迫后雪上一枝蒿种子恢复萌发情况。

将不同NaCl浓度梯度下15 d后未萌发的种子取出，用蒸馏水冲洗干净后，置于铺有灭菌滤纸，并用蒸馏水充分浸润的培养皿中，于光照培养箱中20 ℃恒温培养，观察记录雪上一枝蒿种子恢复萌发的情况。

3)未萌发雪上一枝蒿种子活力检测。

30 d后将未萌发的雪上一枝蒿种子取出，沿种胚纵切后，分别置于蒸馏水(对照)及2%的TTC染液中进行避光染色，20 min后将种子取出镜检，观察染色情况并统计种子活力。

1.3 数据分析

实验数据采用Microsoft excel 2016软件进行处理，采用SPSS 24.0软件进行统计分析及作图。

2 实验结果

2.1 雪上一枝蒿种子活力统计

由表1可以看出，不同来源地成熟的雪上一枝蒿种子生活力有显著差异，在后续实验结果分析过程中，以生活力测定值对萌发数据进行加权处理。

表1 不同来源雪上一枝蒿环境特征及种子活力检测结果

2.2 环境胁迫对雪上一枝蒿种子萌发的影响

2.2.1温度对雪上一枝蒿种子萌发的影响

由表2可以看出，20 ℃条件下雪上一枝蒿萌发率最高，不同来源雪上一枝蒿种子萌发率对温度的响应不同。随着温度升高，雪上一枝蒿种子初始萌发时间提前(图1)。低海拔地区(甘肃甘南舟曲)来源的种子在较低温度(10 ℃)无法萌发(表2，图1)；随着温度升高，雪上一枝蒿种子萌发能力先增强后减弱并受到抑制(图1)，而高海拔地区(云南丽江玉龙)来源的种子受影响更为强烈(表2)，且在高温(30 ℃)环境下无法萌发。

表2 雪上一枝蒿种子萌发率对温度的响应

2.2.2酸碱度对雪上一枝蒿种子萌发的影响

pH值为5.0条件下，丽江玉龙雪山地区来源的种子萌发率降低，pH值8.5条件下，甘肃舟曲地区来源的种子萌发率显著降低。除此以外，不同pH值环境下，雪上一枝蒿各组间种子萌发率没有显著差异。

由萌发进程(图2)可以看出，不同pH值条件对不同来源雪上一枝蒿种子初始萌动时间及总体萌发时长影响不大。丽江玉龙雪山地区来源的种子萌发呈双峰曲线，甘肃舟曲地区来源的种子呈单峰曲线。

2.2.3盐分胁迫对雪上一枝蒿种子萌发的影响

由表3可以看出，在较低NaCl浓度(0.1%)下，雪上一枝蒿种子萌发率显著降低，高海拔地区(云南丽江玉龙)来源的种子在0.5%NaCl浓度下仍可萌发。当环境NaCl浓度超过1%，种子无法萌发。

表3 不同pH值条件下雪上一枝蒿种子萌发率

表4 雪上一枝蒿种子萌发率对盐分胁迫的响应

在NaCl胁迫条件下，雪上一枝蒿种子萌发进程缩短，萌发数量减少(图3)。高海拔地区(云南丽江玉龙)来源的种子在0.5%NaCl浓度下萌发推迟。

2.3 解除环境胁迫后雪上一枝蒿的种子萌发特征

2.3.1解除温度及盐胁迫后雪上一枝蒿种子恢复萌发受试样本描述

（4）供求关系严重失衡，人员素质不高。建筑市场供求关系严重失衡，生产能力明显过剩，过度竞争导致了无序竞争甚至是恶性竞争。

在温度胁迫解除的实验中，低温组(云南玉龙)有部分种子萌发，取未萌发的种子；高温组(甘肃舟曲)有部分种子萌发，取未萌发的种子。低温胁迫组选择10 ℃组，高温胁迫组选择30 ℃组，其中，受试样本量描述如下：

1)云南丽江玉龙区域。低温组(10 ℃)包括：第1组46粒、第2组45粒、第3组46粒；高温组(30 ℃)每组50粒，3组。

2)Ⅱ甘肃甘南舟曲区域。低温组(10 ℃)包括：每组50粒，3组；高温组(30 ℃)包括：第1组34粒，第2组35粒、第3组36粒。

在盐分胁迫解除的实验中，取每个盐分胁迫条件下未萌发的种子，以保持受试种子为同一批并减少干扰，解除胁迫后受试样本量描述如下：

1)云南丽江玉龙区域。0.1%浓度包括：第1组46粒，第2组45粒，第3组47粒；0.5%浓度包括：每组46粒，3组；1%浓度包括：每组50粒，3组；5%浓度包括：每组50粒，3组。

2)甘肃甘南舟曲区域。0.1%浓度包括：第1组32粒，第2组31粒，第3组33粒；0.5%浓度包括：每组50粒，3组；1%浓度包括：每组50粒，3组；5%浓度包括：每组50粒，3组。

2.3.2解除温度胁迫后雪上一枝蒿种子萌发特征

表5 解除温度胁迫后雪上一枝蒿种子萌发率特征

解除环境温度胁迫后，雪上一枝蒿种子萌发时间均大大提前(1～2 d内即开始萌发)，萌发进程缩短(由6～9 d缩短至3～7 d)(图4)。

2.3.3解除盐分胁迫后雪上一枝蒿种子萌发特征

丽江玉龙雪山地区来源的种子经过盐分胁迫后，没有萌发的种子已经死亡(表6)；甘肃舟曲地区来源的种子在0.5%NaCl浓度下即没有萌发，一旦环境胁迫解除，仍保持较高萌发率。当环境NaCl浓度超过1%后，所有种子均无萌发。

表6 解除盐分胁迫后雪上一枝蒿种子萌发率特征

3 分析与讨论

3.1 不同来源雪上一枝蒿种子萌发对环境因子的响应

不同来源地雪上一枝蒿种子对萌发环境温度体现了一定的选择和适应性，这是植物在野外生存过程中长期自然选择的结果。赵迪等[15]研究指出，在同样的温度条件下，不同海拔下露蕊乌头(Aconitumgymnandrum)高海拔来源种子萌发率高于低海拔来源，但整体萌发率较低，休眠现象明显。本研究结果与之不一致，可能由于物种差异，种子休眠程度不同导致。此外，20 ℃条件为雪上一枝蒿最适萌发温度，这与船盔乌头(Aconitumnaviculare)[16]及工布乌头(Aconitumkongboense)[17]萌发特性相一致。

土壤酸碱度常会干扰植物种子萌发和植株生长[18]，雪上一枝蒿种子萌发受萌发环境酸碱度影响较小，pH值在5.5～8.0范围均可有效萌发。即使来源不同的种子，其萌发受酸碱度影响也较小。在雪上一枝蒿实际播种过程中，对播种基质酸碱度没有明显要求，但土壤酸碱度对植物生长过程的影响，还需进一步研究。在盐胁迫下，除了部分沿海滩涂以及盐碱地生长的植物外[19-20]，许多植物种子萌发和幼苗生长会受到明显抑制，抑制程度与盐浓度和植物自身耐盐能力有关[21-23]。丽江玉龙雪山来源的雪上一枝蒿种子呈现一定的耐盐性，这与其生长环境多为林缘荒地及流石滩下缘有关。尽管雪上一枝蒿种子具有一定耐盐性，但其对盐胁迫响应仍非常敏感，即使在0.1%NaCl浓度下，其萌发率也会显著降低，在播种前期，应提前分析种植地的土壤含盐量及盐分组成并采取相应措施，以缓解盐胁迫对种子萌发带来的危害。

3.2 解除环境胁迫后雪上一枝蒿种子恢复萌发

过低和过高的温度会使膜的透性、膜结合的活性和酶变性而影响种子萌发[24]。温度胁迫解除后，甘肃舟曲来源的雪上一枝蒿种子萌发可恢复到较高水平。丽江玉龙雪山来源的种子恢复萌发的能力显著低于前者，且高温胁迫下的种子恢复萌发的能力显著低于低温胁迫。研究结果一方面体现了环境条件改变后植物适应能力的强弱，同时也暗示丽江玉龙雪山地区来源的雪上一枝蒿在引种繁育过程中难度较大。尽管高海拔恶劣的环境条件(昼夜温差、强紫外线)能刺激药用植物次级代谢产物的积累[25]，药效更佳，但考虑其繁育的难度及成本，在种植栽培管理过程中应综合考虑种源来源对药材生产的影响。

盐胁迫对植物种子萌发的影响主要表现在降低种子发芽率，延长种子萌发进程，或者使种子失去活力[26-27]。结合盐胁迫实验以及胁迫解除实验结果来看，不同来源雪上一枝蒿种子在应对环境盐胁迫时策略不同。由于生长环境影响，丽江玉龙雪山来源的种子仍能在高盐浓度下萌发生长，而不能萌发生长的种子则失活死亡；甘肃舟曲来源的种子则选择抑制萌发，等待萌发环境适宜后再萌发生长。环境过滤对于不同区域相同物种种子萌发产生的影响不同，丽江玉龙雪山区域生长的植物种子活力较低、环境选择压力较大，部分强壮的种子在恶劣环境下也可以萌发生长；甘肃舟曲区域植物种子活力较强，环境选择压力较小，只会在适宜条件下萌发生长。