基于SRAP标记的大蒜种质资源遗传多样性分析

李晋华, 冷家归, 罗莉斯, 王少铭, 侯颖辉, 李德文

(1.贵州省农业科学院香料研究所, 贵阳 550006; 2.贵州省农业科学院油料研究所， 贵阳 550006)

大蒜(AlliumsativumL.)是百合科葱属一年生草本植物，具有较高的药用和食用价值，用途广泛、加工产品种类多样，深受人们的喜爱。我国是世界上最大的大蒜生产国和出口国，大蒜品种资源丰富，种植区域广泛。近年来，培育出了很多符合不同需求的新品种，但是由于定向选育与淘汰在增加了大蒜品种的同时，也降低了遗传多样性。为了更有效地保护和利用大蒜种质资源，对大蒜的研究也越来越受重视[1-3]。

目前关于大蒜的研究主要集中在品种培育[4]、病虫害防治[5-6]、生化成分[7]、遗传多样性[8-9]等方面。随着分子生物学的发展，遗传多样性已经从形态标记、同工酶标记、细胞标记发展到分子标记技术。基于基因组水平的分子标记技术在大蒜遗传多样性研究中被广泛应用，刘新雨等[10]从大蒜转录组序列中共鉴定出141 132个SSR位点，利用筛选到的6条SSR引物对35份供试材料进行扩增，多态性条带为26条，在遗传相似系数0.756 9处35份材料被分为五类。王海平等[11]用AFLP、SSR 和 InDel 三种标记分析212份大蒜种质资源的遗传结构与遗传背景，结果发现，三种标记的引物共获得清晰可辩的位点502个，多态性位点 492 个，不同引物揭示的大蒜基因多样性指数分布在 0.17～0.38之间。王丹丹等[12]采用正交实验建立了大蒜近缘种的SRAP反应体系，为大蒜近缘种进一步研究提供技术支持。

相关序列扩增多态性(sequence related amplifiedpolymorphism,SRAP)是一种新型的基于 PCR 扩增的标记技术[14]。由于 SRAP 具有不需预知物种的序列信息、高效快速、多态性好、扩增稳定、重复性高等优点[15]，广泛应用于种质资源的遗传图谱构建、品种鉴定[16]、遗传多样性与亲缘关系等领域[17]。本研究以贵州省农业科学院香料研究所种植的96份大蒜种质资源为材料，通过SRAP分子标记技术探索其遗传多样性与群体的亲缘关系，为大蒜种植资源的保护、利用及进一步研究提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试的96份大蒜种质资源种植于贵州省农业科学院香料研究所贵阳试验地香料资源圃(北纬26°，东经106°，海拔1 127 m)，其中74份来自贵州省的9个市、自治州，其余22份分别来自重庆、云南、湖北等8个省、直辖市(表1)。主要试剂：dNTPs、10×TaqBuffer(Mg2+)、Taq酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司，DL 1500 DNA Marker购自中国高端生物试剂有限公司，琼脂糖、30%聚丙烯酰胺、50×TAE Buffer等均购自索莱宝生物工程(北京)有限公司。主要仪器：NanoDropTMND-1000核酸蛋白测定仪(Thermo，美国)、C 1000 Touch PCR仪(BIO-RAD，美国)、DYCZ-30 C型双板夹芯式垂直电泳仪和DYY-6 C型双稳定时电泳仪电源(北京六一生物有限公司)。

表1 供试材料的基本信息

1.2 基因组DNA提取与检测

选取大蒜嫩叶，采用改进的CTAB法提取基因组DNA，在提取液中加入2% 的 β-巯基乙醇以除去酚类物质。DNA浓度在微量核酸浓度测定仪上测定，然后通过用1%的琼脂糖凝胶95 V电泳30 min检测所提DNA的质量与完整性。

1.3 PCR电泳

SRAP引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，从 864 对引物组合中筛选出22对扩增清晰、重复性好的引物组合，采用降落PCR(touchdown PCR)进行扩增。SRAP-PCR扩增体系为10.0 μL：模板DNA 1.5 μL，dNTPs 0.2 μL，10×TaqBuffer(Mg2+)1 μL，Taq酶 0.2 μL，Me引物0.5 μL，Em引物 0.5 μL，ddH2O 补足至10.0 μL，每个PCR反应体系设2个重复。扩增程序为：94 ℃预变性6 min；94 ℃ 45 s，53～48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，进行10个循环，退火温度每循环下降0.5 ℃；94 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，进行30个循环；72 ℃延伸7 min，12 ℃保存。扩增产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，恒压 300 V，电泳1 h，用银染法显色，然后拍照记录。

1.4 数据统计与分析

电泳结束后进行人工读带，在相同的位置上清晰的条带记为1，没有的条带记为0，建立0，1原始矩阵。统计扩增产物的总条带数和多态性条带数，其中，多态性条带比率P(%)=(多态性条带数/总条带数)×100%。用Popgene 32软件统计观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei基因多样性指数(H)、Shannon’s多样性信息指数(I)、群体总基因多样性(Ht)、群体内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst)、基因流(Nm)。根据Popgene 32软件计算出的遗传一致度利用NTSYS pc-2.1软件按非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 引物扩增多态性分析

用筛选出的22对引物对供试材料进行PCR扩增(图1～图2)。从扩增结果(表2)可以看出，22对引物共扩出173条带，平均每对引物扩出7.86条，其中多态性条带161条，多态性条带比率为93.66%，不同的引物扩出的总条带数有差异，多态性条带数介于5～10之间，平均每对引物检测出的多态性位点为7.32条。扩增位点数最多的引物组合是Me 26-Em 18，扩出了10条带；其次为Me 7-Em 13、Me 7-Em 17，扩出9条带；扩增条带最少的是Me 7-Em 22和Me 8-Em 20，都只扩出了5条带。PIC在0.635 7～0.889 7之间，引物组合Me 7-Em 22的PIC最低，为0.635 7，Me 26-Em 18的PIC最高，为0.889 7。无论是扩增条带的大小，还是扩增条带的多少，不同的引物在同一个采样点大蒜样品的扩增结果存在差异，同一引物在不同材料之间的扩增结果也不同。这说明供试的大蒜种质资源间存在丰富的多态性。因此，利用SRAP分子标记可以从DNA水平检测出大蒜种质资源间的差异。

表2 SRAP 引物扩增产物的多态性

2.2 大蒜种质资源亲缘关系分析

用Popgene 32软件对96份大蒜种质资源的遗传多样性参数进行分析，结果表明，遗传一致度范围为0.347 8～0.819 9，遗传距离范围为0.035 1～0.802 4，Na为2.000，Ne为1.800 0，H为0.434 8，平均I为0.623 3，大蒜虽为无性繁殖植物，但具有一定的遗传多样性。

利用NTSYS-pc 2.1软件对 96份大蒜材料进行聚类分析，得到相应的UPGMA树状图(图3)，在遗传相似系数为0.58时将96份供试材料分为五类，第Ⅰ类包含73份大蒜材料，第Ⅱ类包含8份大蒜材料，第Ⅲ类包含一份大蒜材料，第Ⅳ类包含8份大蒜材料，第Ⅴ类包含6份大蒜材料。

2.3 不同大蒜群体种质资源亲缘关系分析

利用Popgene 32软件对18个大蒜群体之间的遗传距离和遗传一致度进行计算(表3)，结果表明，遗传一致度范围为0.633 5～0.974 4，遗传距离范围为0.025 9～0.456 4。遗传一致度最高的是毕节与凯里的供试大蒜材料，其遗传距离为0.025 9，遗传一致度最低的是江苏与四川的供试材料，其遗传距离值最大为0.456 4，说明其亲缘关系最远。

表3 供试材料的遗传一致度与遗传距离

对供试的18个大蒜群体进行遗传多样数参数分析，结果见表4。18个群体的Na在1.000 0～1.962 7之间，Ne在1.000 0～1.605 5之间，H介于0.144 1～0.355 7之间，I在0.210 3～0.529 7之间，N.P.B在56～155之间，PPB介于34.78%～96.27%之间。四川和江西这两个地点都只有一份供试材料，因此Na和Ne都是1.000 0。H、I、N.P.B、PPB都是安顺市的大蒜群体多样性最低，说明该地大蒜的遗传多样性最低，遵义市大蒜群体的各个遗传多样性指数均为最高，说明其遗传多样性最高。

表4 18个供试大蒜群体的遗传多样性指数

96份供试大蒜种质资源总的遗传多样性指数如表5所示，群体总基因多样性Ht为0.363 3，群体内基因多样性Hs为0.232 3，Gst为0.360 4，Nm为0.887 4。整体来说，96份供试大蒜资源的多样性较丰富，群体内的基因多样性较高，群体间和群体内的基因交流较为频繁，供试材料丰富的遗传多样性可以为种质资源的保护、利用和良种培育提供材料。

表5 96份供试材料的遗传多样性指数

2.4 UPGMA聚类分析

利用NTSYS-pc 2.1软件对18个大蒜群体进行聚类分析，得到相应的UPGMA树状图(图4)，在遗传相似系数为0.83时，将供试大蒜群体分为五类：第Ⅰ类包含贵州省的遵义、六盘水、凯里、毕节、贵阳、铜仁、黔西南、黔南、黔东南以及甘肃、山东、湖北、云南、重庆14个大蒜群体;第Ⅱ类为湖南大蒜群体；第Ⅲ类为贵州省安顺市大蒜群体；第Ⅳ类为江苏省大蒜群体；第Ⅴ类为四川省大蒜群体。

第一类在遗传系数为0.88时被分成七个亚类。第一个亚类包含贵州省5个市大蒜材料和甘肃省的4份大蒜材料，说明甘肃省与贵州省5个市的大蒜材料遗传背景相似，亲缘关系较近；第二个亚类为山东的大蒜群体；第三个亚类为湖北的大蒜群体；第四个亚类为铜仁的大蒜群体；第五个亚类为云南的大蒜群体；第六个亚类为重庆的大蒜群体；第七个亚类为黔东南苗族侗族自治州的大蒜群体。可见，大蒜种质资源聚类结果主要由品种差异决定，受地域影响较小。

3 结论与讨论

SRAP 分子标记具有其独特的优点，已经被广泛地应用于种质遗传多样性和亲缘关系的分析研究。王少铭等[18]利用 SRAP 分子标记对48份薄荷种质资源进行了亲缘关系和遗传多样性分析，结果表明，供试薄荷种质资源的遗传相似系数范围为0.67～0.97；张颖聪等[19]利用28 对 SRAP 引物，对 20 份番木瓜种质资源进行了遗传多样性分析。此外，SRAP 分子标记在香蕉[20]、菠萝[21]、菠萝蜜[22]等作物上都有相关应用。由此说明，SRAP 分子标记技术能较好地反映种质资源的遗传变异，可用于开展大蒜种质资源遗传多样性分析。

本研究以收集的18个群体96份大蒜种质资源为材料，分析其遗传多样性。PCR反应中，引物的退火温度直接影响扩增结果，因此在实验中需要花费大量的时间来摸索最适的退火温度，利用降落PCR进行扩增，设置温度区间进行降温扩增，在不需要摸索退火温度的前提下就可以到达最好的扩增效果。从扩增结果来看，22对引物共扩出161条多态性条带，引物的PIC在0.64～0.89之间，SRAP 标记的遗传相似性系数范围为 0.67～0.97, 表明 96 份大蒜种质资源具有较丰富的遗传多样性。对 96 份大蒜种质资源的 SRAP 分子标记进行聚类分析，在遗传相似系数约为 0.83 时96 份大蒜种质资源分成 5 个群集。引物的多态性不仅反映了大蒜种质基因组的多态性，也反映了遗传变异的差异性。

目前，有关大蒜种质资源的遗传多样性分析研究已有报道。刘新雨等[10]随机选择的14对SSR引物中有12对引物能进行有效扩增，其中有6对具有良好的多态性，多态率达50%，平均每对多态性引物可扩增得到4.33条带，低于本研究的7.63条，表明SRAP标记对大蒜种质资源的多态性检出率高于SSR。对35份大蒜种质资源进行遗传多样分析，结果显示35份种质可聚为五大类群，遗传相似系数为0.67～0.97, 高于本研究的0.70～0.97，说明本研究所采用的大蒜种质资源遗传背景相对较窄，今后应加强大蒜种质资源的引进与利用。

本研究中大蒜的 SRAP 分子标记聚类分析结果与传统的分类结果基本相同，但也存在差异，可能与取样过程中量的多少、基因组 DNA 的提取方法、PCR 扩增体系的异同等有一定的关系。自然环境条件的复杂性、多样性也可能是造成这种差异的原因。随着标记技术的不断成熟与应用，更多的分子生物学方法将被应用于大蒜种质资源的鉴定和亲缘关系的研究中，如SSR[23]、ISSR、AFLP 等。在今后的研究工作中，应进一步采取多种分子标记法对同一大蒜种质资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析。