衰老影响小鼠脊髓组织锌转运体表达及细胞凋亡的实验研究

张传杰， 田 鹤， 梅晰凡

(1.锦州医科大学 附属第一医院, 辽宁 锦州 121001；2.锦州医科大学 基础医学院， 辽宁 锦州 121001)

0 引言

衰老是一种复杂的生理、病理现象，衰老的个体不仅生理功能下降而且对外界环境变化的应激能力明显减弱。随着年龄的增加，脊髓出现形态和功能的改变，影响感觉和运动[1]。老龄的脊髓椎管变窄，灰质中神经元数量减少，神经递质合成能力下降，突起数量减少[2]。锌是人体内含量丰富的微量元素之一，参与多种生理活动，也调控一些疾病的发生发展。神经元富含锌离子，10%～15%的锌离子位于突触小泡内，锌离子的稳态受锌结合蛋白和锌转运体调控[3]。锌转运体(Zinc transporter,ZnT)家族包括至少10个成员，即ZnT1-ZnT10，它们负责将锌离子从细胞质转运到细胞外，或者将胞质内的锌离子转运到细胞器内。研究报道，ZnT1-ZnT10在脊髓灰质前角和后角的神经元内均有不同程度的表达[4]。本课题组在之前的研究中证实锌离子稳态的失衡以及锌转运体表达的改变与脊髓损伤关系密切，适量补充锌离子可明显减少神经元的凋亡[5]。本研究旨在通过比较青年小鼠和老年小鼠脊髓组织中锌转运体表达和凋亡相关蛋白含量的差异，为了解脊髓老化的病理、生理机制提供参考，为指导老龄患者脊髓病变的治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周龄10只，18～20月龄10只，体重25～30 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于锦州医科大学实验动物中心，动物饲养环境SPF级，自由食水，自然光暗周期，室温22～25℃。纳入实验的老年组小鼠血液生化指标正常，但行动迟缓。本研究过程的所有操作符合动物伦理学的标准和要求。ZnT1抗体(absin)、ZnT3抗体(proteintech)、ZnT6、ZnT10抗体(biorbyt)、Bax、Bcl-2抗体(CST)、GAPDH抗体(abcam)。免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。DAB显色剂(碧云天生物公司)。BCA蛋白质测定试剂盒(碧云天生物公司)。羊抗兔二抗(abcam)。PVDF膜(millipore)。ECL发光液(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 标本制备

青年和老年组小鼠各5只，3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，预冷的4%多聚甲醛心脏灌流固定，取出L5-6节段脊髓组织，4%多聚甲醛固定48 h以上。梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，用于形态学观察。青年组和老年组小鼠各5只，麻醉后快速剥离脊髓组织，冻存于-80℃，用于Westernblot检测。

1.3 小鼠脊髓组织HE染色

包埋好的石蜡块制成5 μm厚的切片。烘干后的切片常规脱蜡至水。苏木精染色5 min，盐酸乙醇分色3 s，流水冲洗，伊红染色5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。

1.4 小鼠脊髓组织中ZnT1、ZnT3、ZnT6、ZnT10免疫组织化学染色

脊髓组织石蜡切片，脱蜡至水，3% H2O2室温封闭10 min去除内源性过氧化物酶活性，高压修复抗原，室温冷却，山羊血清封闭10 min，滴加一抗(ZnT1 1∶200；ZnT3 1∶150；ZnT6 1∶100；ZnT10 1∶200)，4℃过夜。PBS清洗切片，滴加多聚物，室温孵育15 min，PBS清洗，滴加二抗，室温孵育15 min，PBS清洗。DAB显色，苏木素染色细胞核，脱水，透明，中性树胶封片。显微镜下观察拍照。

1.5 小鼠脊髓组织中ZnT1、ZnT3、ZnT6、ZnT10表达量的体视学测量

每组每种抗体选取5张免疫组化染色图片，每张图片按照“S”形选取5个高倍视野，通过目镜方格测试系统、点记数法，分别测算ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10的体密度值，计算公式如下：

体密度值：VV=ΣPX/ΣPC

式中，PX为方格测试系统落在阳性表达部位的点数；PC为方格测试系统落在参照系的点数。

1.6 小鼠脊髓组织中Bax和Bcl-2蛋白表达的免疫印迹检测

取冷冻待用的脊髓组织，超声粉碎机粉碎后加入裂解液，4℃裂解30 min。离心取上清液，BCA法测总蛋白浓度，加入上样缓冲液，加热变性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭60 min，裁膜后加一抗(Bax 1∶500；Bcl-2 1∶500；GAPDH 1∶2000)，4℃孵育过夜。TBST洗涤，加入羊抗兔IgG (1∶5000)，室温孵育1 h，TBST洗膜，应用ECL试剂显色，采集条带图像，应用Image J软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白/GAPDH量化蛋白。

1.7 统计分析

使用SPSS 19.0统计分析，数据用均数±标准差表示，应用ANOVA检验和t检验进行组间差异比较，P<0.05表明具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

脊髓灰质中含大量的运动神经元，由胞体和突起构成，胞体大小不等，形状各异。如图1所示，青年小鼠脊髓组织中神经元数量多、结构完整、尼氏体含量丰富。而老年小鼠的脊髓组织中神经元数量较少，突起也较少。

图1 小鼠脊髓组织HE染色(A，B：青年小鼠脊髓；C，D：老年小鼠脊髓)

2.2 免疫组织化学染色及体视学分析结果

在脊髓灰质神经元内可见到ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10的表达，阳性反应产物呈棕褐色。ZnT1表达于神经元的胞膜、胞质、胞核和突起中。ZnT3和ZnT6表达于核周质和突起内。与青年小鼠比较，老年小鼠脊髓神经元内ZnT1、ZnT3和ZnT6的体密度值均减弱。ZnT10表达于胞质和细胞核，老年小鼠脊髓组织中ZnT10的体密度值高于青年小鼠，如图2和表1所示。

图2 青年和老年小鼠脊髓组织中ZnTs表达(SP，scale bar=50μm)

表1 青年和老年小鼠脊髓组织ZnTs体密度值(mm-1)

2.3 免疫印迹检测结果

与青年小鼠比较，老年小鼠脊髓组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(P<0.01)，促凋亡蛋白Bax的表达明显升高(P<0.01)，如图3所示。

图3 青年和老年小鼠脊髓组织中Bax和Bcl-2蛋白表达比较(** P<0.01)

3 讨论

目前，人口老龄化的趋势日益加剧，据统计，到2050年，全球60岁以上的老年人口将达到21亿。衰老是糖尿病、心血管疾病及神经退行性疾病的主要危险因素。近年来，学者们通过体视学等研究方法对中枢神经系统的衰老进行了深入研究[6]。脊髓受年龄的影响早于脑，随着年龄的增长,脊髓在形态学和生理特性等方面都会出现相应的改变。研究发现，老年大鼠脊髓神经元凋亡增加，线粒体减少，尼氏体减少，突触数量减少，谷胱甘肽等生化物质代谢改变，胶质细胞增生，感觉和运动功能下降明显[7]。本实验选取自然衰老且运动迟缓的老年小鼠L5-6节段的脊髓组织，检测神经元数量、形态和凋亡相关蛋白。HE染色结果显示老年小鼠脊髓灰质前角中运动神经元数量显著减少，且尼氏体的含量也下降。神经元数量的减少是运动迟缓的主要原因。为分析神经元数量减少的原因，本研究应用免疫印迹方法检测Bcl-2和Bax的表达情况，Bcl-2和Bax是线粒体细胞凋亡信号通路中的重要基因，Bcl-2抑制细胞凋亡，而Bax则与Bcl-2形成同源或异源二聚体，促进细胞凋亡[8]。结果显示：与青年小鼠比较，老年小鼠脊髓组织中Bcl-2的表达显著降低，而Bax的表达明显升高，Bax/Bcl-2比例上升。这一结果提示我们Bax/Bcl-2比例的改变导致线粒体膜通透性增加，激活一系列级联反应，引发神经元凋亡，影响小鼠运动能力[9]。

锌是人体重要的微量元素，由于咀嚼不充分和药物的相互作用等原因，老年人血液中锌离子含量普遍偏低，锌缺乏是老年人常见病和死亡的一个重要诱因[10]。脊髓内的神经元富含锌离子，锌离子稳态失衡与脊髓损伤和肌萎缩侧索硬化等疾病关系密切。锌离子不能自由通过细胞膜,锌的转运和代谢需要特定的转运体和膜通道。目前的研究发现锌转运体(ZnT)家族至少有10个成员，它们结构相似，含丰富的组氨酸，可与锌离子结合。ZnTs的主要功能是将锌离子运出细胞或聚集到细胞器内，降低胞质内的锌浓度。ZnT1-ZnT10在脊髓中均有表达，ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10在脊髓相关疾病中研究较多。ZnT1的主要作用是将胞质中的锌离子运到细胞间隙中[11]；ZnT3能将胞质内的锌离子转运到突触小泡内[12]；ZnT6将胞质中的锌离子转运到高尔基体内[13]；ZnT10调控锌和锰的排出[14]。本研究应用免疫组织化学染色和体视学分析检测老年和青年小鼠脊髓内ZnT1、ZnT3、ZnT6和ZnT10的表达变化。结果显示：ZnT1在神经元的细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达；ZnT3和ZnT6表达于胞质内；ZnT10表达于胞质和核，与青年组比较，老年组小鼠ZnT1、ZnT3和ZnT6的表达减弱，但ZnT10的表达升高。这一结果提示，老年小鼠脊髓组织中锌转运体表达异常，这与衰老机体锌离子水平下降有一定的关系，而锌转运体的异常也会导致神经元内锌离子的分布改变，稳态失衡，胞质内锌离子的异常聚集会诱导形成淀粉样斑块，进而影响神经元的状态和生存，影响感觉和运动功能。

本研究证明，衰老小鼠脊髓组织内锌转运体表达异常，影响神经元的功能和生存，同时衰老也影响Bcl-2和Bax蛋白的表达，从线粒体途径诱发神经元凋亡[8]，影响小鼠的运动能力。今后的研究中，我们会对锌离子代谢进行干预，运用更先进的研究手段深入探讨脊髓老化的病理生理机制，为老龄患者脊髓病变的治疗提供更多的靶点。