基于微滴式数字PCR技术的HER2基因扩增用于乳腺癌TNM分期的研究

黄 波，张艺超，林建山

(深圳市宝安人民医院普外二区，广东 深圳 518101)

乳腺癌是威胁女性健康的恶性肿瘤之一，每年乳腺癌新发100多万例，死亡40多万例[1]。乳腺癌类型较多，因而明确乳腺癌类型，制定合适的治疗方案，准确评估预后，才能取得最佳的治疗效果[2]。有研究显示，人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)作为多变量分析中的一个独立预后指标，可判断乳腺癌的恶性程度[3]。HER2的标准化检测、乳腺癌患者HER2基因表达的规律及TNM分期等在临床实践中对于预测患者的预后、提高乳腺癌诊治水平有着积极的意义[4]。目前，可通过免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测HER2蛋白的表达，通过荧光原位杂交方法(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测HER2基因扩增的水平[5]。然而现有的HER2检测方法，结果判读具有主观性，也易受到取样及处理方法的影响，且HER2存在基因融合、断裂等现象，FISH检测结果存在假阴性的可能[6]。微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术是一种新型的绝对定量PCR方法，与实时荧光定量PCR技术相比，其具有灵敏度高、定量准确、检测的线性范围宽、特异度高、成本低等优点，极具发展潜力[7]，但其结果的可靠性有待进一步证实。因此，本研究选择我院收治的乳腺癌患者的标本进行研究，分析ddPCR技术用于HER2基因扩增的价值及在评估乳腺癌TNM分期中的应用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

从我科乳腺癌标本库中选择2015～2017年行手术治疗的100例乳腺癌患者的标本作为观察组，其中TNMⅠ～Ⅱ期71例，Ⅲ～Ⅳ期29例。纳入标准：经病理学检查确诊为乳腺癌；IHC 3+或FISH法检测HER2阳性；年龄≥18岁。排除标准：肝肾功能不全；合并其他肿瘤；严重精神病史；存在其他重大器官疾病；临床资料缺失。同期选择80例乳腺增生患者的组织标本作为对照组。2组患者的年龄、绝经比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究经我院医学伦理委员会批准。

表1 患者临床资料比较

1.2 方法

构建HER2基因扩增ddPCR方法：采用QX200 ddPCR系统检测HER2基因扩增，将MixDNA样品按16∶4的比例混合，制备反应混合物。取20 μL反应体系置于微滴发生器的样品孔中，每孔加入70 μL微滴生成油，合上微滴生成仪，覆盖垫圈墨盒，启动生成仪，形成20 000个纳米级的油包水微滴。每孔取40 μL油包水微滴加入96孔板。铝箔热封膜密封，置于Bio-Rad C1000热封膜仪上，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s进行40个常规的PCR扩增反应循环。将96孔板放入QX200微滴检测仪中，利用检测仪自带的控制分析软件设置样本孔条件，启动检测仪，根据泊松分布原理获得标本起始分子的绝对拷贝数，将结果导出并保存。检测HER2基因相对扩增倍数，相对扩增倍数(n)=目标基因拷贝数/内参基因拷贝数，当n≤1.2时为阴性，当n>1.2时为阳性。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HER2基因相对扩增倍数检测

观察组患者HER2基因相对扩增倍数高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组中TNM Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者HER2基因相对扩增倍数高于TNM Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。Spearman相关性分析结果显示，HER2基因相对扩增倍数与TNM分期呈正相关(r=0.632，P<0.05)。

图1 HER2基因相对扩增倍数检测结果

2.2 ddPCR检测分析乳腺癌患者TNM分期的价值

使用ddPCR技术检测乳腺癌患者HER2基因分析TNM分期的敏感度和特异度均大于90%，且曲线下面积(areaundercurve,AUC)>0.95(图2)，相关性分析有统计学意义，说明基于ddPCR技术的HER2基因相对扩增倍数可作为评估乳腺癌患者TNM分期的参考依据。

图2 ROC曲线图

3 讨论

2018年2月，国家癌症中心发布了最新的全国癌症统计数据，乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位，约占16.51%，乳腺癌的防控形势非常严峻[8]。根据基因不同，可将乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型(其中Luminal B型又细分为Luminal B HER2阴性型和Luminal B HER2阳性型)、HER2过表达型、三阴型[9]。不同类型乳腺癌治疗方法也不同，Luminal A型乳腺癌以内分泌治疗为主；Luminal B型乳腺癌要考虑多种辅助治疗相结合；三阴型乳腺癌尚无针对性治疗方法，以化疗为主；20%～30%的乳腺癌患者为Luminal B HER2阳性型，是各种分型中较为凶险的一个亚型，相比其他类型乳腺癌其恶性程度更高，疾病进展更快，更容易复发和转移，严重威胁患者的生命[10]。

HER2/neu基因是乳腺癌细胞中重要的表皮生长因子受体家族成员，也是目前乳腺癌治疗的药物靶点之一。有研究显示，若乳腺癌患者HER2过表达，则其生存期极易缩短，导致不良结局[11]。现阶段临床应用过程中参考《乳腺癌HER2检测指南》，而该指南中推荐使用IHC与FISH和/或显色原位杂交结合方案检测HER2的表达，但均存在分析结果主观性、检测耗时长、操作繁琐等缺点，导致其临床应用存在一定的局限性[12-13]。

ddPCR技术是近年来临床逐渐推广应用的新型检测技术，可有效分析HER2基因拷贝数，定量分析HER2的DNA以及RNA水平[14]。ddPCR技术在使用过程中通过将反应体系均分到大量反应单元中，独立进行PCR扩增，检测每个反应单元的荧光信号(荧光信号产生过程参考qPCR)，根据泊松分布和阳性比例计算核酸数量[15]。本研究采用ddPCR技术检测乳腺癌患者的标本，结果显示，TNM Ⅲ～Ⅳ期的患者HER2基因相对扩增倍数高于TNM Ⅰ～Ⅱ期的患者；相关性分析结果显示，ddPCR技术检测的HER2基因相对扩增倍数与TNM分期呈正相关；进一步分析发现，ddPCR技术检测乳腺癌患者HER2基因分析TNM分期的敏感度和特异度均大于90%，且AUC>0.95，具有较高的应用价值。ddPCR技术可对基因序列进行高灵敏度的检测，在检测过程中无需采用标准品即可实现DNA的绝对定量；此外，ddPCR技术检测HER2基因时，不依赖扩增效率和Ct值，可有效避免PCR抑制剂的影响，对样本容忍度较高。结合本研究进一步分析认为，ddPCR技术可有效分析HER2表达水平和拷贝数，通过精准定量分析为乳腺癌分子分型提供数据支持，ddPCR计数可有效筛选出低丰度的基因表达并开展鉴定分析，对于乳腺癌患者病情的评估具有重要作用。

综上所述，使用ddPCR技术检测乳腺癌患者HER2基因相对扩增倍数与乳腺癌TNM分期呈正相关，该方法预测TNM分期的敏感度和特异度均较高。但本研究并未详细分析ddPCR技术检测HER2基因相对扩增倍数与乳腺癌患者预后质量的关系，有待后续进一步研究。