电流型酶电极生物传感器抗可逆抑制剂干扰的测定方法

朱思荣，毕春元，杜祎，张金玲，高广恒，张利群，赵晓华，杨艳

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省科学院生物研究所 山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250103)

电流型酶电极生物传感器是把具有生物活性的酶与电化学电极结合在一起的复合型传感器，通常由过氧化氢电极和产过氧化氢的氧化酶组成，酶反应产物过氧化氢在电极表面还原为水和氧气，释放电子，产生电极流。传感器关键元件为具有催化活性的酶，通常是把酶固定化在载体膜上，再把膜紧贴在电化学电极上，也可把酶直接固定在电化学电极上。由于酶催化反应只对其特定底物起作用，所以酶电极生物传感器具有专一性好、反应速度快，灵敏度高的优点，不需要对待测样品进行特殊处理，就能快速检测样品内的特定成份。目前酶电极生物传感器已广泛应用于临床生化检验、食品分析、发酵检测等领域。

酶电极生物传感器由固定化酶和电化学电极组成，所以任何影响酶催化反应和电化学电极电流大小的外部因素都会对测定分析形成干扰，影响仪器的分析测定精度。目前研究较多的是对电化学电极的干扰，因为一些具有氧化还原活性的小分子会在电极表面反应，产生电极电流，影响测定的准确性。Shitanda等[1]根据酶电极对干扰物和测定物具有不同响应速度的特点，利用小波变换算法排除抗坏血酸对电流型酶电极生物传感器的干扰。Serkan等[2]在葡萄糖流动注射分析系统中用样品流过装填不溶性NaBiO3的流动腔，使样品基底中的氧化还原活性物质如抗坏血酸、多巴胺、尿酸在到达测定电极之前转化为无活性的氧化态，使样品中的抗坏血酸干扰降低96%，多巴胺干扰降低86%，尿酸干扰降低98%。何原子等[3]以纳米Au修饰煤基活性炭为电极固载葡萄糖氧化酶，该系统对0.05 mol/L的尿酸和抗坏血酸干扰因素未引起显著电流反应。由于酶活抑制剂的存在会显著抑制酶的催化活性，酶传感器也通常用于酶抑制剂的检测，如用乙酰胆碱酯酶传感器检测可逆抑制剂石杉碱甲和加兰他明[4]、毒扁豆碱[5]、黄曲霉毒素B1[6]和有机磷农药[7-9]，用酪氨酸酶传感器检测黄曲霉毒素M1[10]，用葡萄糖氧化酶测定生物毒性痕量金属离子[11-12]，用酪氨酸酶和葡萄糖氧化酶双酶检测双酚A(BPA)、苯酚、Cr(III)、葡萄糖和Cr(VI)[13]。但对于抗酶活抑制剂干扰的处理方法目前尚未见报道。

1 电流型酶电极生物传感器测定原理

酶是一种特殊的具有生物活性的蛋白质，其生物活性随保存时间的增长或测定样品次数的增加会逐步降低，但这是一个很缓慢的过程，短时间(数分钟到数十分钟)内其活性变化很小，可以忽略不计。酶电极生物传感器的应用正是基于酶的这一特点。通常在用酶电极检测前，先用标样连续检测酶电极的响应电流，直到酶电极的响应电流基本恒定(误差小于分析测定要求)，然后再检测被测样品，根据酶电极对被测样品的响应电流，与标样比较，计算出被测样品的浓度。在电化学电极表面酶反应产物是一个生成与扩散的平衡状态[14]，实际浓度与产物生成速度(即酶反应速度)成正比。根据酶促反应的米氏定律，酶催化反应的反应速度V与反应底物浓度S的关系为：

(1)

因为反应速度V与传感器电极电流成正比关系，可以导出酶电极响应电流与底物浓度的关系为：

(2)

其中:C为电极响应电流;a为常数,与Vmax成一定的比例关系;b=Km即米氏常数;S为底物浓度。

酶电极的线性校正就是通过定标时的标样浓度及响应电流、线性校正时的标样浓度及响应电流这两组数据，按式(2)求出常数a和b，测定时再通过样品响应电流及常数a和b，计算出测定样品的浓度。

2 抗抑制剂干扰实现

在测定底物中存在酶活性抑制剂的情况下，由于标样定标时不存在酶活抑制剂，酶活较高，而在样品测定中因酶活抑制剂的存在，酶活性较低，这样定标过程和测定过程酶活基本不变这一测定的基本条件不再存在，所以用常规法测定无法得到准确的分析结果。只有使酶传感器的定标过程和测定过程处于同一酶反应的环境中，才能保证传感器的酶活基本不变。本文提供的抗干扰测定方法就是用标样在样品测定环境中对酶活进行二次标定，消除酶活抑制剂对测定过程的影响。具体测定过程如下：

测定时先按常规方法对酶电极进行定标。如有必要在定标完成后对酶电极进行校线性操作，确保在标样浓度范围内，酶电极的测定结果与样品浓度一致。定标完成后进行测定操作，测定分两步进行，第一步仅取样品测定，为防止在第二步测定中样品浓度超限，测定时样品的进样量改为常规法的一半，反应结束后获得测定结果R1，第二步用与第一步等量的样品加上与样品等量的标样进行测定，获得测定结果R2。

如样品中有酶活抑制剂存在，则测定结果会明显偏低。考虑到进样量仅为正常定标时的一半，测定结果R1与实际样品浓度X的关系为：

(3)

其中K为为酶活抑制系数。

第二步测定因为所加的样品量与第一步相同，所以反应系统中酶活抑制剂含量与第一步测定相同，酶活抑制系数可视为不变。测定结果R2与实际样品浓度X的关系为：

(4)

其中St为标样浓度，根据式(3)和(4)可以算出：

(5)

(6)

两次测定结束后，根据两次测定结果R1和R2，按式(5)计算出抑制系数K，再按式(6)计算出实际样品浓度X。因抗干扰测定方法中每个待测物的抑制系数不同，所以在正常定标和校线性后，每个样品至少要测定两次才能获得分析结果，虽然测定速度慢一些，但在样品中有酶活抑制剂干扰的情况下，这种测定方法去除了抑制剂的影响，测定结果更准确、更可靠。

3 酶抑制剂对测定的影响及抗抑制剂干扰法测定实验

3.1 实验试剂与仪器

3.2 用常规分析方法测定含(NH4)2SO4的标准样品

图1 (NH4)2SO4浓度对葡萄糖、谷氨酸生物传感器分析结果的影响Fig.1 Influence of (NH4)2SO4 concentration on the analysis result of glucose and glutamic acid biosensors

表1 含(NH4)2SO4样品对葡萄糖、谷氨酸生物传感器的影响(10次测定结果)

3.3 用抗抑制剂干扰法分析含离子样品

测定前先按常规法用标准样品进行酶活定标，然后用1/2浓度标样对传感器校线性，确保在标样浓度范围内传感器对样品测量有很好的线性关系。定标和校线性按常规分析法进行。进样量为20 μL。

完成正常定标和校线性后用抗干扰法测定干扰样品，为使测定结果不超线性范围，样品量改为10 μL，测定分两次进行，第一次向反应池注入10 μL待测样品，待反应结束后获得一组测定结果，因为进样量是常规法的一半，所以该结果乘2即为按常规测定的结果，第二次向反应池注入10 μL待测样品加10 μL标样。待反应完成，再次获得一组测定数据。根据两次测定结果按式(5)、(6)计算出抗干扰校正结果。第二次测定时样品和标样的总进样量为20 μL，只要待测样品浓度不超标样太多，测定就不会超出传感器线性范围。

图5 不同浓度抑制剂下葡萄糖、谷氨酸重复测定变异系数比较Fig.5 Comparison of the coefficient of variation of glucose and glutamic acid for repeated determination under different concentrations of inhibitors

表2 抗抑制剂干扰法测定(NH4)2SO4浓度为10 mmol/L标准样的重复测定结果

从图2～4抗干扰校正后的结果可见，虽然用本方法重复测定的变异系数相对大，但抗酶活抑制剂的干扰效果明显，分析结果更接近实际浓度。在检测存在酶活抑制剂的样品时可有效提高分析精度，降低分析误差。由于本方法在第二次测定中使用标样计算抑制系数，也有同定标相似的效果，测定过程酶活少许改变不会影响分析结果，测定过程可以适当延长定标的时间间隔。

表3 抗抑制剂干扰法测定(NH4)2SO4浓度为5 mmol/L标准样的重复测定结果

表4 抗抑制剂干扰法测定(NH4)2SO4浓度为2 mmol/L标准样的重复测定结果

图2 10次重复测定(NH4)2SO4浓度为10 mmol/L标准样的结果比较Fig.2 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 10 mmol/L (NH4)2SO4

图3 10次重复测定(NH4)2SO4浓度为5 mmol/L标准样的结果比较Fig.3 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 5 mmol/L (NH4)2SO4

图4 10次重复测定(NH4)2SO4浓度为2 mmol/L的标准样的结果比较Fig.4 Comparison of 10 repeated determinations of a standard sample with 2 mmol/L (NH4)2SO4

4 结语

酶电极生物传器以其测定速度快、专一性好、成本低等优势在医疗、发酵、食品、体育训练等多个领域有广泛的应用。对于测定对象成份相对稳定的试样，如人体血液样品，干扰是可预期的,并多为电极干扰,可以采取针对性的防干扰措施，获得高精度测定结果。但在工业领域中，测定对象极其复杂，如发酵液样品，在发酵后期菌体量极大，各种代谢产物复杂，其中极有可能有未知的酶活抑制剂，常规检测方法获得的测定结果偏差较大，限制了酶电极在这些领域中的应用。本文设计的测定方法可有效消除酶抑制剂对测定结果的影响，降低酶电极生物传感器在工业领域应用中的测定误差，有较好的应用前景。