臭氧水对土传病原真菌的杀灭作用

李红梅，魏艳丽，扈进冬，杨凯，刘宝军，杨合同，李纪顺

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省科学院生态研究所 山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250103)

病原真菌引起的土传病害能够造成农作物及设施瓜果蔬菜大面积减产，甚至绝产，且难以防治。由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、灰霉菌(Botrytiscinerea)等致病菌引起的土传病害危害极大[1-3]，这些病原菌都能够在土壤中以菌核、分生孢子或菌丝体越冬，如果上茬作物发病严重，需要对土壤进行消毒后才能种植下茬，否则土传病害会大面积发生，造成绝产。目前土壤消毒方法主要有物理消毒法和化学消毒法[4]，化学消毒法不但使病原菌产生抗药性，且容易造成土壤污染，而生产上常用的高温焖棚等物理消毒方法易受季节影响。因此，亟需寻找一种绿色、高效的土壤处理方法。

臭氧是一种强氧化消毒剂，可杀灭各种微生物[5-6]，溶于水后具有更强的杀菌作用[7]，且臭氧水易于分解、无污染、廉价高效，是理想的新型杀菌剂。臭氧水对病原真菌的抑制和杀灭效果的研究多见于只针对一种病原真菌[8-10]，少数研究针对两种病原真菌[11]，而针对3种及以上多种土传病原真菌的研究较少。本研究利用臭氧水对3种土传病原真菌进行杀灭试验，筛选适宜的臭氧水质量浓度及最佳作用时间，以期为土壤的绿色消毒技术提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

臭氧水发生器(山东泽恩农业科技股份有限公司)；启立DOZ-30臭氧浓度检测仪(广州启立环保设备有限公司)。

1.1.2 菌株及培养基

病原真菌(尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、灰霉菌)及深绿木霉20111(Trichodermaatroviride)均为本实验室分离保存。

PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉15 g/L，蒸馏水1 L， pH自然。

1.2 方法

1.2.1 真菌孢子悬浮液制备

将本实验室保藏的病原真菌尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、灰霉菌转接至PDA固体培养基上，28 ℃培养3～5 d，待有大量孢子产生时，刮取孢子至无菌生理盐水中震荡混匀，无菌擦镜纸过滤，滤液即为孢子悬浮液。

1.2.2 臭氧水对真菌孢子的杀灭试验

(1)

1.2.3 臭氧水对土壤中病原真菌的杀灭试验

将培养好的病原菌制备孢子悬浮液，并稀释到一定质量浓度，在显微镜下用血球计数板进行计数，将孢子悬浮液与土壤混匀，调整土壤中孢子数为105cfu/g干土，作为病土装入花盆(19 cm×16 cm)，1000 g/盆，浇灌臭氧水质量浓度设为5 、10 mg/L，浇灌量500 mL/盆(以盆底有水流出为宜)，进行以下处理：(1)对照CK，浇灌自来水；(2)处理T1，臭氧水浇灌1次；(3)处理T2，臭氧水浇灌2次，间隔5 d；(4)处理T3，臭氧水浇灌3次，各间隔5 d。每处理3个重复，处理结束后，取各处理土壤，采用选择性培养基对土壤进行病原菌计数[12-14]，杀灭率按公式(1)计算。

1.2.4 臭氧水处理对接种尖孢镰刀菌白菜幼苗的影响

将制备好的尖孢镰刀菌孢子悬浮液与土壤混匀至105cfu/g干土，装入花盆(19 cm×16 cm)，1000 g/盆，浇灌臭氧水质量浓度设为5 mg/L，浇灌量500 mL/盆，共浇灌3次，间隔5 d，处理如下：(1)对照CK，浇灌自来水；(2)臭氧处理：土壤浇灌臭氧水；(3)木霉处理：土壤浇灌自来水，白菜种子浸种木霉20111孢子悬浮液(浓度为4.3×105cfu/mL)；(4)臭氧处理+木霉处理：土壤浇灌臭氧水，白菜种子用木霉20111孢子液浸种(浓度同处理(3))。以上各处理3个重复，土壤湿度合适时进行播种，常规管理。4周后调查白菜发病情况及株高、干重、叶绿素含量等生长指标，计算各处理的病株率和防治效果。

,

(2)

(3)

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 21.0 统计软件中的Duncan′s 方法进行分析，结果为3次重复的平均值±标准差。

2 结果

2.1 臭氧水对病原真菌孢子的杀灭作用

由图1可知，各质量浓度的臭氧水对3种病原真菌都有杀灭作用，在1.0～5.0 mg/L范围内，杀灭率随臭氧水质量浓度增加而增大。当质量浓度为1.0 mg/L时，0.5 min内对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌及灰霉菌的杀灭率分别为70.4%、74.2%、72.7%，随着时间的延长，杀灭率没有明显升高；当质量浓度上升到2.0 mg/L时，0.5 min内对3种病原真菌的杀灭率分别为96.2%、97.5%、97.4%；当质量浓度达到5.0 mg/L时，0.5 min对3种病原真菌的杀灭率都达到100%。可见臭氧水质量浓度显著影响病原菌的杀灭率，而处理时间对杀灭率没有显著影响。

注：图中不同小写字母表示P<0.05水平差异显著。图1 臭氧水对3种病原真菌孢子的杀灭效果Fig.1 The sterilizing effect of ozone water on the spores of the pathogenic fungi

2.2 臭氧水对土壤中病原真菌的杀灭作用

利用两种质量浓度的臭氧水对土壤中的3种病原真菌进行灭菌处理，由图2可以看出，当臭氧水质量浓度为5 mg/L时，对3种病原菌的杀灭率随处理次数的增加而显著增加；质量浓度为10 mg/L时，处理2次、3次对3种病原真菌的杀灭率与处理1次差异显著，而处理2次与3次之间差异不显著。

注：图中不同小写字母表示P<0.05水平差异显著。图2 臭氧水对土壤中病原真菌的杀灭效果Fig.2 The sterilizing effect of ozone water on the pathogenic fungi in soil

2.3 臭氧水处理对接种尖孢镰刀菌白菜幼苗的影响

臭氧水处理接种病原菌的土壤后种植大白菜，结果如表1所示。臭氧水消毒土壤后，能显著降低白菜枯萎病的发病率，臭氧处理和臭氧+木霉处理发病率降低至2.5%和6.25%，与对照以及木霉处理间存在显著差异。臭氧水处理土壤后直接播种，对白菜幼苗的生长有一定影响，植株明显矮小，株高和单株干重与其他处理间差异显著。木霉浸种处理能有效缓解臭氧水消毒土壤后对植株的影响，其株高和干重都与对照无显著差异。臭氧水处理土壤后白菜幼苗叶片的叶绿素含量不受影响，各处理间无显著差异。

表1 臭氧水处理对白菜幼苗的影响

3 讨论

臭氧水杀菌作用强，可杀灭各种微生物。本文用臭氧水处理105数量级的真菌孢子悬浮液，当臭氧水质量浓度为1 mg/L时，0.5 min内对3种病原菌孢子的杀灭率在70.4%～74.2%；当臭氧水质量浓度上升为2 mg/L时，0.5 min的杀灭率迅速升高到96.2%～97.4%。而作用时间对杀灭率无显著影响，可见质量浓度是影响臭氧水杀菌效果的关键因素，这与已报道的试验结果[15]一致。

臭氧水对土壤中3种病原真菌的杀灭试验表明，5 mg/L的臭氧水处理3次与10 mg/L的臭氧水处理2次都能达到很好的杀菌效果。实际生产中高浓度臭氧水不易获得，所以采用多次浇灌的方法能有效防治土壤病虫害。

臭氧对微生物的杀灭作用无选择性，所以对土壤处理后有益微生物菌群会受到破坏。本试验中臭氧处理的白菜幼苗生长受到影响，植株明显矮小，株高和单株干重都与其他处理差异显著，而添加木霉处理的植株不受影响，株高和单株干重都与对照无显著差异，这可能是木霉的施入明显改善了土壤消毒后的有益菌群，使植株健康生长。有报道称植株在生长期进行臭氧水浇灌，能显著提高叶片的叶绿素含量、SPAD值[16-17]，本试验中，种植前土壤浇灌臭氧水，各处理间的叶绿素含量无显著差异，这可能与臭氧水浇灌时间以及臭氧水质量浓度有关。

试验结果表明，臭氧水浇灌可作为土壤绿色消毒技术，但消毒后需要添加有益微生物来重建土壤中的微生物生态系统，以达到植株健康生长的目的。