基于四臂嗅觉仪内轨迹跟踪的昆虫嗅觉行为分析体系
2021-08-18孙琳琳石佳敏常学飞叶恭银
孙琳琳, 张 璇, 石佳敏, 常学飞, 叶恭银, 汪 芳
(浙江大学农业与生物技术学院, 水稻生物学国家重点实验室, 杭州 310058)
在自然界中，昆虫通过接收寄主散发的化学物质或者释放及接收昆虫信息素为自己选择适宜的食物及繁殖场所，躲避和防御天敌，避免竞争或在竞争中战胜对手(郑卫青等, 2014; 任炳忠等, 2017)。植食性昆虫能够利用寄主植物所释放的化学信号来进行寄主定向。比如马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata易受马铃薯叶片气味吸引；许多为害松树的鞘翅目害虫如天牛科、象甲科、小蠹虫科及郭公甲科的昆虫能被松树气味吸引，访花昆虫能被植物花散发的气味吸引(Chénier and Philogène, 1989; 杜家纬, 2001; Haverkampetal., 2018)。昆虫信息素对昆虫的定向、召唤、交尾、产卵、聚集、追踪、告警、防御以及种间识别等行为也具有重要的作用(郑卫青等, 2014; Albajes and Maderia, 2019)。利用信息化合物开发引诱剂、驱避剂等调控型农药，是害虫绿色防控的重要发展方向，已成为害虫综合治理的重要措施之一(Albajes and Maderia, 2019)。苹果醋、葡萄汁、梅子酒、酵母等被用于斑翅果蝇Drosophilasuzukii的监测预报以及诱杀(Bianchietal., 2020; Chenetal., 2020; Papanastasiousetal., 2020)；昆虫信息素也被广泛应用于虫情监测和诱杀，特别是鞘翅目、鳞翅目和襀翅目石蝇科的昆虫(李咏玲等, 2010; Hanks and Millar, 2016; Villalobosetal., 2017; Seyboldetal., 2018; Hafsietal., 2019)。然而，不管是植物还是昆虫释放的信息化合物，大多都不是单一组分的化合物，而起作用的可能是其中的一种或几种组分。例如对天牛科起作用的松树气味主要是松针叶挥发物中的单萜成分，包括α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和莰烯等(Chénier and Philogène, 1989; Miller and Rabaglia, 2009)；桉树精油对家蝇的驱避效应可能是由于其中的单萜类物质1,8-桉树脑的作用(Tarellietal., 2009)；一些植物花中的芳樟醇对夜蛾科、菜蛾科和天蛾科的昆虫具有吸引作用(Raguso, 2016; Heetal., 2019)。分离鉴定起主要作用的化合物组分是研究利用信息化合物的基础。
筛选和鉴定对昆虫有作用的挥发物组分的技术手段主要包括两大类。一类是通过电生理技术测定昆虫嗅觉感受器对气味化合物的电反应，从而在一系列的化学物质中筛选有效化合物，称为触角电位技术；气相色谱与触角电位的联用能快速准确地对未知信息化合物进行鉴定(张尚卿等, 2010)。但相对来说，气相色谱-触角电位联用技术要求高，对一些小型昆虫，取触角、触角与电位的连接等操作难度大。另一类是通过昆虫的行为反应来筛选和鉴定挥发物组分的，包括嗅觉仪和风洞技术等。其中，风洞试验是一种模拟昆虫田间飞行活动空间的物理模型，多用于测定鳞翅目昆虫的行为反应(周弘春和杜家纬, 2001)。Y型嗅觉仪是最早用于昆虫嗅觉行为研究的技术手段(李源等, 2010; 王利华等, 2012; 徐蕾等, 2016)；四臂嗅觉仪近来被应用于一些活动性较强的昆虫的嗅觉行为分析(秦卓和康育光, 2014; 吴耀军等, 2015)。
黑腹果蝇D.melanogaster是行为学研究常用的模式生物，其嗅觉行为研究常用的手段包括Y型嗅觉仪、四臂嗅觉仪、T型迷宫等，一些试验以肉眼观察人工计数，一些则采用商业化的软件或自编的程序对相机采集到的视频进行分析(Stensmyretal., 2012; Linetal., 2015; Brownetal., 2019)。相较而言，人工观察试验会因人为因素对试验结果产生一定的影响且数据不可再现。本研究将轨迹跟踪分析系统与四臂嗅觉仪的结合，比较分析了气流速度、味源设置等实验条件对黑腹果蝇嗅觉反应的影响，提出了更为精细的实验技术体系，为其在其他小型昆虫中的应用提供基础；同时，我们也进行了多头试验与单头试验效果的比较，发现单头试验效果优于多头试验。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
试验所用黑腹果蝇D.melanogaster为实验室人工饲料继代饲养的W1118野生型品系，培养条件为:温度25±1℃，相对湿度65%±1%，光周期12L∶12D。人工饲料配比：水1 000 mL，玉米粉82 g，绵白糖62 g，琼脂粉6.2 g，丙酸5 mL，酵母粉2～5 g。选取羽化后3-7 d的雌成虫进行实验，在试验前将果蝇保湿饥饿处理17～24 h。
1.2 仪器与试剂
市售发酵型苹果醋饮料(山东烟台绿杰股份有限公司)、吐温-20[生工生物工程(上海)股份有限公司]、蓝桉Eucalyptusglobulus叶油(澳大利亚慧凝有限公司)。用去离子水将吐温-20稀释成5%的水溶液，然后用5%吐温-20溶液将蓝桉叶油稀释至5%, 1%, 0.2%, 0.04%和0.02% 5个浓度。
四臂嗅觉仪参考Vet等(1983)和Faucher等(2006)所描述的装置在东莞市嘉城仪器公司定制，以聚四氟乙烯材料制成。行为测试区为13 cm×13 cm，高1.2 cm，内部为四角星状空间，底部中心有一个圆孔(直径0.5 cm)用于释放昆虫和连接气泵。其基本组成以及连接顺序为：流量计→活性炭干燥塔→味源瓶→四臂嗅觉仪→抽气泵(图1: A)，各部分以硅胶管[TYGON LMT-55，圣戈班高功能塑料(上海)有限公司]相连，干燥塔(G.G.-17，250 mL，南京雪莱生物科技有限公司)内装有400 g柱状活性炭(4.0 mm)。实验前，硅胶管、味源瓶在75%乙醇中浸泡后用蒸馏水冲洗，四臂嗅觉仪内腔用75%乙醇擦拭，于阴凉通风处晾干。试验时，四臂嗅觉仪置于自制试验箱(80 cm×60 cm×88 cm)内的毛玻璃台上，毛玻璃下方设有LED光源(220 V, 50～60 Hz, 中山市八度照明有限公司)，摄像机(HDR-PJ610, SONY, 日本)固定于四臂嗅觉仪的正上方，用于录制受试昆虫在四臂嗅觉仪内的行为反应(图1: B)。实验时，试验箱外用遮光布覆盖，室内温度保持25±1℃。
图1 四臂嗅觉仪连接示意图(A)和试验箱(B)
1.3 气流速度的筛选及其对黑腹果蝇雌成虫嗅觉行为的影响测定
无味源试验：4个味源瓶中均加入20 mL去离子水，在四臂嗅觉仪中央接入1头黑腹果蝇雌成虫。采用负压式气泵(CAMSONAR SIM-4，北京卡索众和科技有限公司)抽气，利用流量计(CAMSONAR，北京卡索众和科技有限公司)设置300, 600, 1 200和2 400 mL/min 4个进气流速度，用摄像机录制15 min内黑腹果蝇在四臂嗅觉仪内的行为反应。每个气流速度下录制15头黑腹果蝇雌成虫的行为。
有味源试验：在味源瓶中分别加入20 mL测试味源物溶液(苹果醋或0.2%蓝桉叶油)及相应对照(去离子水或5%吐温-20溶液)，其他操作方法同上所述。每个气流速度下录制15头黑腹果蝇雌成虫的行为。
为防止四臂嗅觉仪内实际进入气流的速度大小与流量计示数不符，实验过程中，在味源瓶与四臂嗅觉仪之间接入另一流量计进行检测，得到两流量计示数相同。活性炭对气流阻力的影响可忽略不计。
1.4 味源设置对黑腹果蝇雌成虫嗅觉行为的影响测定
单味源：在其中一臂对应的味源瓶中加入20 mL味源物(苹果醋或0.2%蓝桉叶油)，其余3臂对应的味源瓶加入等量的对照物(去离子水或5%吐温-20溶液)。对角线味源：在四臂嗅觉仪对角线两臂的味源瓶中各加入20 mL味源物(苹果醋或0.2%蓝桉叶油)，另一对角线的两味源瓶内加入等量的对照物(去离子水或5%吐温-20溶液)。在四臂嗅觉仪中央接入1头黑腹果蝇雌成虫，气流速度为300 mL/min，录制并分析15 min内黑腹果蝇的行为反应。每种味源设置录制15头黑腹果蝇雌成虫的行为。
1.5 味源物对黑腹果蝇雌成虫多个体的行为效应测定
按单味源设置在味源瓶中加入相应的味源物或对照，在四臂嗅觉仪中央接入10～12头黑腹果蝇雌成虫，气流速度为300 mL/min，录制并分析40 min内黑腹果蝇的行为反应。每个味源物设置5组重复。
1.6 不同浓度蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫的驱避效应测定
在一个味源瓶加入20 mL蓝桉叶油(5%, 1%, 0.2%, 0.04%和0.02%)，其余3个味源瓶加入等量的5%吐温-20溶液。在四臂嗅觉仪中央接入 1头黑腹果蝇雌成虫，气流速度为300 mL/min，录制15 min内果蝇的行为反应，每个浓度设置15次重复。
以上所有试验操作在每次试验结束后，将嗅觉仪旋转90°，并用75%乙醇擦拭四臂嗅觉仪内腔；每录制2次视频，更换味源物质以及味源臂位置。
1.7 数据分析
采用Ethovision XT软件[诺达思(北京)信息技术有限公司]对黑腹果蝇的行为反应进行分析，包括其在四臂嗅觉仪各区域内的累计停留时间及平均速度。单头试验取接虫后5-15 min的视频分析黑腹果蝇对味源物的行为反应，多头试验取接虫后5-35 min的视频进行分析，0-5 min内几乎不动的个体(移动速度低于0.02 cm/s)视为无行为反应个体被排除；软件捕获的四臂嗅觉仪各区域停留总时长小于分析总时长(单头试验，600 s；多头试验，1 800 s)的80%的个体作为无效分析个体被排除。无味源物的气流速度试验采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey氏多重比较来分析黑腹果蝇在各区域内停留时长的差异。有味源物的单头试验采用t测验比较味源臂区域与对照区域黑腹果蝇停留时长的差异显著性。多头试验采用卡方分析每组中被吸引/驱避的个体数与无吸引/驱避的个体数的差异。引诱指数(attraction index,AI)的计算参考Lin等(2015)所描述的方法，具体公式如下所示。味源设置、试验个体数对AI的影响采用t检验进行分析，气流速度、味源物浓度对AI的影响采用单因素方差分析及Tukey氏多重比较来分析各处理下AI的差异。数据均采用DPS软件(version 18.10)进行分析，百分比数据在分析时进行反正弦转换。
引诱指数(AI)=
2 结果
2.1 最适气流速度的筛选
在嗅觉仪的四臂均通入经活性炭过滤的洁净空气，4个气流速度下黑腹果蝇雌成虫在嗅觉仪各区域的停留时间如图2所示。在300, 600, 1 200和2 400 mL/min4个气流速度下，黑腹果蝇雌成虫在4个区域内的停留时长均无显著性差异(P>0.05)(图2: B-E)，表明实验体系对黑腹果蝇雌成虫的行为无影响。对4个气流速度下黑腹果蝇雌成虫的平均运动速度进行分析发现：当气流速度为300 mL/min时，黑腹果蝇雌成虫不同个体间的运动速度最为均一(图2: F)，因此认为300 mL/min是最适气流速度并用于后续试验。
图2 不同气流速度下黑腹果蝇雌成虫在四臂嗅觉仪内的行为反应
2.2 味源设置对苹果醋引诱效果的影响
我们比较了单一臂放置和对角线两臂放置苹果醋味源对黑腹果蝇雌成虫引诱效果的影响，结果如图3所示。当单一臂放置苹果醋味源时，黑腹果蝇雌成虫在苹果醋味源区域的停留时长占比为52.80%，约为对照区域的停留时长占比(13.18%)的4倍(P<0.01)(图3: A)；而当对角线放置苹果醋味源时，黑腹果蝇雌成虫在苹果醋味源和对照区域的停留时长占比分别为32.49%和15.01%(P<0.01)(图3: B)。两种味源放置下，苹果醋对黑腹果蝇雌成虫均有显著的吸引效果，味源放置方式对引诱指数AI无显著影响(P=0.18)(图3: C)；但与对角线两臂放置苹果醋味源相比，单一臂放置苹果醋味源的实验效果更佳。
图3 味源放置方式对苹果醋(AV)引诱黑腹果蝇雌成虫效果的影响
2.3 气流速度对苹果醋引诱效果的影响
在4个气流速度下，苹果醋对黑腹果蝇雌成虫均有显著的吸引作用(P<0.05)(图4: A)。在气流速度为300，600，1 200和2 400 mL/min时，果蝇在苹果醋味源区域的停留时长占比分别为66.12%(n=14), 54.53%(n=13), 76.28%(n=11)和49.23%(n=14)。气流速度对苹果醋的引诱指数AI有显著的影响(P=0.033)(图4: B)；在气流速度为1 200 mL/min时，苹果醋的AI最高，显著高于气流速度为2 400 mL/min时的AI，但与气流速度为300和600 mL/min时的AI无显著差异(P>0.05)。然而，气流速度为1 200 mL/min时，无效个体数较多(26.7%)。
图4 气流速度对苹果醋引诱黑腹果蝇雌成虫效果的影响
2.4 苹果醋对黑腹果蝇雌成虫多个体的吸引效应
考虑到如果能同时对黑腹果蝇雌成虫多个体进行测试，将大大节省试验时间，因此进行了苹果醋对黑腹果蝇雌成虫多个体的吸引效果试验。每组试验接入10头黑腹果蝇雌成虫，利用软件追踪每头雌成虫在四臂嗅觉仪在各区域内的活动情况；将AI大于0.2(即在苹果醋味源区域的停留时长占比大于30%)的雌成虫定义为被吸引个体，AI为-0.2～0.2之间的为无响应个体，小于-0.2的为被驱避个体，统计每组试验中各类别的个体数。5组试验的有效个体总数为41头，其中被苹果醋吸引的雌成虫为28头，无响应的雌成虫13头，被驱避的0头，平均AI为0.42，苹果醋对黑腹果蝇雌成虫有吸引效果(χ2=4.78,P=0.028)。但就每组单独来看，被苹果醋吸引的黑腹果蝇雌成虫数占有效个体总数的50.0%～87.5%，并不是每组试验都有显著的吸引效果(图5)。
图5 苹果醋对黑腹果蝇雌成虫多个体的引诱效果
2.5 不同浓度蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫的驱避效应
已有报道表明蓝桉叶油对家蝇具有驱避、毒杀幼虫和蛹的特性(Abdel Halim and Morsy, 2005)。我们测试了不同浓度蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫的驱避效应。当味源臂为5%, 1%, 0.2%和0.04%蓝桉叶油时，黑腹果蝇雌成虫在对照区域的停留时长占比显著高于在味源臂区域的停留时长占比(P<0.01)(图6: A-D)，4种浓度蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫均有显著的驱避作用。而当蓝桉叶油浓度降为0.02%时，黑腹果蝇雌成虫在味源臂区域内的停留时长与对照区域无显著差异(P=0.193)(图6: E)。浓度对蓝桉叶油的驱避效应有显著的影响(P=0.056)，0.2%蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫驱避效果最佳，与浓度为0.02%的蓝桉叶油存在显著的差异(P<0.05)，与其他浓度的AI差异不显著(P>0.05)(图6: F)。
图6 不同浓度蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫的驱避效应
2.6 味源放置对蓝桉叶油驱避效果的影响
在单一臂和对角线放置味源时，0.2%的蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫均有显著的驱避效应(P<0.01)(图7: A, B)。黑腹果蝇雌成虫在对照区域的停留时长占比(单一臂33.26%，对角线41.04%)均显著高于在味源区域的停留时长占比(单一臂0.21%，对角线7.28%)。但单一臂放置蓝桉叶油味源物比对角线放置味源对黑腹果蝇雌成虫的驱避效应更好(AI的绝对值越高，驱避效应越好)，味源物的设置对蓝桉叶油的驱避效果有显著的影响(P=0.013)(图7: C)。
图7 味源放置方式对蓝桉叶油(EO)对黑腹果蝇雌成虫驱避效果的影响
2.7 气流速度对蓝桉叶油驱避效果的影响
当气流速度为300, 600和1 200 mL/min时，0.2%的蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫均有显著的驱避效应(P<0.01)，黑腹果蝇在味源臂区域的停留时长占比为0.29%～3.52%，在对照区域的停留时长为32.16%～33.23%(图8: A)。但是当气流速度为2 400 mL/min时，黑腹果蝇雌成虫在蓝桉叶油处理区域的停留时长占比与对照区域差异不显著(P>0.05)。气流速度对蓝桉叶油的AI影响不显著(P=0.076)(图8: B)。
图8 气流速度对蓝桉叶油驱避黑腹果蝇雌成虫效果的影响
2.8 0.2%蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫多个体的驱避效应
对每组12头受试黑腹果蝇雌成虫的行为进行分析发现，5组试验的有效个体总数为55头，其中有驱避效应的个体数为48头(AI<-0.2，即在蓝桉叶油味源区域的停留时长占比小于30%)，无响应的个体数为7头(-0.2
图9 蓝桉叶油对黑腹果蝇雌成虫多个体的驱避效果
3 讨论
果蝇种类多、分布广、繁殖力强，黑腹果蝇和斑翅果蝇作为果蝇中的优势种，是葡萄、樱桃、草莓、蓝莓、杨梅等具有较高经济价值的水果上的主要害虫(赵超等, 2017; 高欢欢等, 2018; 代晓彦等, 2019; 王知知等, 2020)。防治果蝇最有效的方法是喷施杀虫剂，但是长期使用化学杀虫剂对环境和人畜都易产生不良的影响，还会导致果蝇抗药性倍增。因此生产上都结合诱杀、“卫生”栽培、天敌昆虫和病原微生物的生物防治等手段进行综合防治(黄贞光等, 2017; 代晓彦等, 2019; 吴玉新等, 2020)。本研究以黑腹果蝇为试验对象，结合四臂嗅觉仪与轨迹跟踪分析系统建立了昆虫嗅觉行为分析体系。利用已报道的对黑腹果蝇有吸引和驱避的化合物验证了实验体系的可靠性；同时，比较分析了气流速度、味源设置等实验条件对黑腹果蝇嗅觉反应的影响，提出了更为精细的实验技术体系，为昆虫信息化合物有效成分的筛选提供了技术支持。
嗅觉仪被广泛应用于昆虫的嗅觉行为分析，四臂嗅觉仪已被应用于果蝇、赤眼蜂、小菜蛾Plutellaxylostella、柑橘木虱Diaphrinacitri、桉树枝瘿姬小蜂Leptocybeinvasa、韭菜迟眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga等昆虫的嗅觉行为研究。大多数已有的报道是通过人为观察来分析昆虫的行为反应的，通过统计各区域内(停留2/4 min以上计1头)或对应收集瓶内的试虫数量来分析味源的引诱或驱避效应(马涛等, 2013; 吴耀军等, 2015; 徐蕾等, 2016)。有少部分研究是采用自己编写或改进的程序来分析统计受试昆虫进入各区域的次数及停留时间(岑伊静等, 2005; 吕燕青等, 2006; Linetal., 2015)，但是试验条件各不相同，有单头试验的、群体试验的；有单一臂放置味源，也有对角线设置味源的。本研究采用的Ethovision XT轨迹跟踪软件原本是针对小鼠等小型动物设计的，目前已被应用于黑尾叶蝉Nephotettixcincticeps、舞毒蛾Lymantriadispar和丹溶腔茧蜂Lytopylusrufipes等昆虫行为的研究(Eberletal., 2018; Wangetal., 2018; Liuetal., 2019)。由于软件是靠灰度识别对个体进行跟踪的，一些昆虫的体色与灰色接近，因此在识别过程中可能会出现部分时间段的跟踪丢失。试验时，将软件捕捉到的时间占视频录制总时间80%以上的作为有效个体，可考虑通过调整光源来改变昆虫的灰度，从而达到更好的分析效果。
昆虫个体大小不同，适应的气流速度也不相同，如赤眼蜂适用的气流速度为100 mL/min，小菜蛾、柑橘木虱等适用气流速度为200 mL/min，韭菜迟眼蕈蚊适用气流速度300 mL/min，桉树枝瘿姬小蜂600 mL/min(何衍彪等, 2004; 吕燕青等, 2006; 吴耀军等, 2015; 徐蕾等, 2016)。因此，需根据受试昆虫本身来确定最适气流速度。可以采用烟雾在嗅觉仪内4个区域是否有明显的界限或气流速度对受试昆虫的行为是否产生影响来确定最适气流速度(段立清等, 2005)。我们的结果表明，无味源时，在4个不同的气流速度下，黑腹果蝇在嗅觉仪内4个区域的停留时长均无显著差异；气流速度对苹果醋的引诱效果有显著的影响，当气流速度为2 400 mL/min时，苹果醋对黑腹果蝇的引诱指数显著下降(图4: A, B)，蓝桉叶油对黑腹果蝇也无驱避效应(图8: B)。因此认为适合于黑腹果蝇嗅觉行为的分析的气流速度为300～1 200 mL/min，气流流速过大可能会导致味源在个区域扩散，从而对受试昆虫的行为产生干扰。考虑到气流速度为300 mL/min时，不同黑腹果蝇个体间活动速度的差异较小，推荐气流速度设置为300 mL/min。
为了分析味源设置、受试昆虫数量是否会对实验产生影响，我们比较了单一味源和对角线味源，单头测试和多头测试条件下的黑腹果蝇行为反应。在两种味源设置下，苹果醋对黑腹果蝇均有显著的吸引效果，味源设置方式对其引诱指数无显著影响，但单一臂放置苹果醋味源时，实验效果更为明显(图3)。两种味源设置下，蓝桉叶油对黑腹果蝇均有显著的驱避效应，味源设置方式对蓝桉叶油的驱避效果有显著影响，单一臂设置味源时，蓝桉叶油的驱避效应显著优于对角线放置味源(图6)。我们的结果表明，无论是有吸引效果的还是有驱避效果的味源物，单一臂设置味源的实验效果更好。不同受试昆虫数量的试验结果表明，不论是苹果醋吸引试验还是蓝桉叶油驱避试验，单头测试的实验效果显著优于多头测试。在多头试验中，虽然最终还是能得出相同的结论，但有可能不同组别的试验结果存在一定的差异。如苹果醋试验中，就有其中两组的实验结果表明黑腹果蝇对苹果醋无明显的行为反应(图5)。因此我们认为，鉴别某种化合物组分对受试昆虫的行为是否存在效应，最可靠的是逐头进行测试；多头测试可用于对化合物的初步筛选。
本研究利用已知的效应味源物对四臂嗅觉仪行为试验体系最优条件进行了探索，结果表明对于某种化合物吸引或驱避效应的鉴别来说，在合适的气流条件下，单一臂设置味源物逐头测试受试昆虫，可得到最优的试验效果；多头试验尽管试验效果没有单头测试好，但可用于化合物的初筛试验。本研究所建立分析体系可用于昆虫信息化合物有效成分的筛选和效应鉴定，在降低人力成本的同时，保证了实验结果的可靠性，为农业害虫的预测预报、生物防治以及卫生害虫的防控提供技术支持。
