小菜蛾溶菌酶Pxlys的基因克隆及其重组蛋白的抗菌活性分析

宁燕夏, 苏月华, 杨 梅

(福建师范大学生命科学学院, 福州 350117)

先天性免疫主要包括细胞免疫和体液免疫，它们既可以单独发挥作用也能相互联系一起抵御入侵的病原生物(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。当机体接收到免疫刺激，如病原微生物入侵或物理机械创伤等，昆虫中的血细胞和脂肪体等会快速合成并释放抗菌肽(例如：天蚕素、凝集素、溶菌酶)等进行防御。目前多种昆虫的溶菌酶被研究，例如：棉铃虫Helicoverpaarmigera在幼虫到蛹的变态发生时溶菌酶表达瞬时增加(Zhangetal., 2009)，蜡螟Galleriamellonella也是幼虫到蛹的变态发生时溶菌酶活性显著增强(Altincicek and Vilcinskas, 2006)，而冈比亚按蚊Anophelesgambiae在不同组织以及不同发育阶段均有溶菌酶的表达(Lietal., 2005)。

溶菌酶属于碱性蛋白酶，通过破坏细菌细胞壁的完整结构(水解肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的糖苷键)，最终导致细菌裂解死亡，可称其为胞壁质酶(muramidase)(York, 2018)。依据来源进行分类，可分为4种类型：动物溶菌酶(c型溶菌酶、g型溶菌酶和i型溶菌酶)、植物溶菌酶、真菌和细菌溶菌酶、噬菌体溶菌酶(Shahmohammadi, 2017; Jietal., 2019)。溶菌酶是一种小分子抗菌肽，是从昆虫的血淋巴中分离纯化出来的抗菌因子之一，又称其为细胞壁溶解酶，主要通过水解细菌细胞壁内的肽聚糖来杀死入侵的病原体，在昆虫的体液免疫中扮演着重要角色。它以非特异性的方式在包括昆虫在内的多种生物体中产生，并作为针对入侵病原体的先天免疫防御的武器库，在缺乏获得性免疫系统的昆虫中起着重要作用(Nayaketal., 2018)。

小菜蛾Plutellaxylostella属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，别名吊丝虫，是危害十字花科蔬菜的世界性害虫之一(Linetal., 2018)，每年全球由小菜蛾造成的经济损失以及防治成本高达40～50亿美元(Furingetal., 2013)。由于小菜蛾世代周期短、繁殖能力强，并对多种杀虫剂产生抗药性，使得对小菜蛾的防治日趋严峻。随着近年来昆虫天然免疫系统研究的深入，科学家开始把眼光集中在基于害虫天然免疫系统为靶标的生物防治技术的开发上。而溶菌酶是动物天然免疫系统中的一类重要效应因子，有研究表明，在蚊子心脏中发现的诱导型免疫因子(溶菌酶 c-1)参与了蚊子的免疫应答(Cardoso-Jaimeetal., 2021)；Liao等(2018)从红色沼泽螯虾克氏原螯虾Procambarusclarkii克隆了一种c型溶菌酶，发现这种溶菌酶能够帮助消除小龙虾血淋巴中的侵入细菌，并通过促进血细胞吞噬作用来保护小龙虾免于死亡；Mai等(2014)从红斑石斑鱼Epinephelusakaara中克隆了编码c型溶菌酶的基因，其编码蛋白为一种组成型和可诱导的急性期蛋白，参与了大肠杆菌Escherichiacoli的先天免疫防御。因此，研究小菜蛾溶菌酶的功能，有助于深入认识小菜蛾的免疫防御机理，为小菜蛾的生物防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 供试生物材料和试剂

1.1.1供试昆虫及饲养：小菜蛾取自福建省福州市闽侯县南通镇，人工饲养，温度为25±2℃，相对湿度为70%～80%，光周期为16L∶8D。幼虫饲喂人工饲料(含小麦胚芽粉37.5 g，酵母20 g，蔗糖10 g，萝卜子粉3 g，尼泊金0.5 g，山梨酸1 g，复合维生素0.8 g，维生素C 1 g，菜籽油1 mL，亚油酸0.1 mL，琼脂粉6 g，加双蒸水250 mL)，成虫喂以10%的蜂蜜溶液。

1.1.2菌株、质粒和试剂：大肠杆菌E.coliDH5α和pET-29a载体由本实验室保存；pMD19-T载体购自TaKaRa公司；大肠杆菌Origami 2(DE3)菌株由福建师范大学生命科学学院舒正玉老师惠赠;停滞棒杆菌Corynebacteriumstationis和藤黄微球菌Micrococcusluteus均购自广东省微生物菌种保藏中心；志贺氏菌Shigellasp.由福建师范大学生命科学学院付新苗老师惠赠；苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)、金黄色葡萄球菌Staphyloccocusaureus、大肠杆菌和沙门氏菌Salmonellasp.为本实验室保存。

Wizard® SV Gel和PCR Clean-Up System DNA胶回收试剂盒和Eastep® Super总RNA提取试剂盒均购自Promega公司；RACE反转试剂盒SMARTer® RACE 5′/3′ Kit Components、ExTaq酶、DNA Marker、T4 DNA连接酶、DNA限制性内切酶BamH I和Hind III均购自TaKaRa公司。

1.2 小菜蛾溶菌酶基因RACE克隆

根据TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书提取小菜蛾3龄幼虫总RNA，按SMARTer® RACE 5′/3′ Kit Components试剂盒合成5′ RACE-Ready cDNA与3′ RACE-Ready cDNA。利用引物(5′-RACE F1: 5′-CTGGCACTTGTTCTTCCA TCCATACC-3′; 3′-RACE F1: 5′-TCTTCTGACTGTGA GCTGGTGAGGG-3′)分别与UPM引物组合，进行第1轮PCR扩增；扩增产物稀释10倍后作为模板，以引物5′-RACE引物(F2: 5′-ACTGCGACGCCTTCG TGATGT-3′)和3′-RACE引物(F2: 5′-GAGACACG GGCAAGGTGAGCA-3′)分别与UPS组合，进行第2轮PCR扩增5′端与3′端目标序列，经胶回收后连接pMD19-T，送至铂尚生物技术(上海)有限公司测序，测序结果用DNAStar进行拼接。

1.3 小菜蛾溶菌酶基因生物信息学分析

对1.2节拼接获得的小菜蛾溶菌酶基因序列进行生物信息学分析。利用ExPASy网站的Protparam(http:∥web.expasy.org/protparam/)分析该蛋白的理化性质；通过SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析该蛋白质是否有信号肽序列；利用在线工具TMHMM-2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析该蛋白质是否有跨膜结构；通过MEGA 7.0软件对序列进行同源比对，同时采用邻接法构建进化树。

1.4 小菜蛾溶菌酶的原核表达与纯化

根据1.2节扩增获得的小菜蛾溶菌酶基因序列，并结合表达载体pET-29a酶切位点信息设计含酶切位点的引物(上游引物引入BamH I，下游引物引入Hind III)：F′引物：5′-CGCGGATCCAAGGTA TTTTCTTCAGACTGTGAGCTGG-3′；R′引物：5′-CCC AAGCTTGCACTTGCTAACATCAGGTAGGGCT-3′。并由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增获得目的基因，扩增体系(20 μL)：ddH2O 10.9 μL，10×ExTaqBuffer 1.5 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，以1.2节的pMD19-T-Pxlys为模板1 μL，ExTaq0.15 μL。扩增程序：95℃ 5 min; 95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 5 min。扩增产物连接pMD19-T，转化至大肠杆菌DH5α细胞，测序正确后，提取质粒；用BamH I酶和Hind III酶对重组质粒pMD19-T-Pxlys和pET-29a质粒进行双酶切后用T4 DNA连接酶进行连接，以构建重组表达质粒pET-29a-Pxlys。将重组表达质粒转化至大肠杆菌Origami 2(DE3)感受态细胞中，筛选重组工程菌。以空载pET-29a作为对照，在严格无菌的条件下，取50 μL验证正确的重组表达菌株接种于含100 mg/mL卡那霉素的5 mL LB液体培养基中，37℃ 230 r/min条件下过夜震荡培养。次日按照1%的接种量，接种于含100 mg/mL卡那霉素的50 mL LB液体培养基中，37℃ 230 r/min震荡培养，使其菌浓度至OD600约为0.6左右，重组菌于IPTG终浓度0.6 mmol/L，温度为16℃，转速为150 r/min条件下诱导培养16 h，以未加IPTG诱导作为对照组，SDS-PAGE法分析蛋白表达情况。批量发酵工程菌株，超声波破碎后，利用ATKA蛋白纯化仪进行Ni柱亲和层析，纯化重组表达蛋白Pxlys，以HiTrapTMDesating柱脱去蛋白液中的咪唑，SDS-PAGE法分析蛋白纯化情况。

1.5 小菜蛾重组蛋白Pxlys的抑菌活性鉴定

1.5.1抗菌谱的检测：参考张洋(2016)和王艺颖(2018)的研究方法，利用牛津杯法检测重组溶菌酶蛋白Pxlys的抗菌谱，该方法是通过观察抑菌圈的大小来判断样品对该菌的抑菌能力，抑菌圈越大说明该蛋白的抗菌能力就越强(马俊, 2016)。取革兰氏阳性细菌停滞棒杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌以及革兰氏阴性细菌大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌划线活化，挑取活化后的单菌落过夜培养，次日按1%的接种量加到30 mL的LB液体培养基中发酵至OD600为0.5，备用。

离心收集1 mL待测菌液，用PBS缓冲液洗涤3次，用1 mL的PBS缓冲液悬浮菌体，经微孔滤膜过滤除菌，取100 μL备好的OD600为0.5的菌液均匀涂布于LB平板；待平板上的菌液干后，用镊子将灭菌后的牛津布置于LB培养基表面，每个平板均匀放置3个牛津杯，吸取1.4节纯化后200 μL的小菜蛾重组蛋白Pxlys液加入到牛津杯中，25℃培养，观察抑菌圈现象，测量抑菌圈的直径采用十字交叉法量取，重复3次。

1.5.2最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的检测：参考李勇(2016)采用液体生长抑制法，离心收集1.5.1节中1 mL已培养好的停滞棒杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，用1 mL LB液体培养基制成菌悬液，并将待测菌稀释至原浓度(OD600约为0.5)的10-4倍；1.4节纯化的重组蛋白Pxlys液经微孔滤膜过滤除菌后，再用已灭菌的PBS缓冲液按2倍比例稀释，取无菌的96孔板，每孔中分别加入100 μL稀释好的小菜蛾重组蛋白Pxlys液和100 μL新鲜配制的菌液，以不加蛋白液用PBS代替的孔为对照组，重复3次；过夜培养，利用酶标仪检测OD600处的吸光值，根据试验孔与对照孔中细菌的生长情况，进行比较判断；菌液吸光值没有增加且肉眼观察无明显细菌生长的对应最低蛋白浓度即为所测菌的MIC。

1.5.3扫描电镜观察细菌细胞的形态：离心收集1.5.1节中1 mL已培养好的停滞棒杆菌和大肠杆菌菌液，用PBS 缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，制成菌悬液，并将待测菌稀释至原浓度(OD600约为0.5)的10-2倍。在停滞棒杆菌中分别加入Pxlys使得终浓度为1×MIC(50 μg/mL)和4×MIC(200 μg/mL)，25℃孵育8 h；在大肠杆菌中分别加入Pxlys使得终浓度为1×MIC(100 μg/mL)和4×MIC(400 μg/mL)，25℃孵育8 h；只加1 mL PBS不加溶菌酶的处理为对照。孵育结束后，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤菌体3～4次，再加入2.5%戊二醛溶液，置于4℃冰箱固定2 h，离心弃去上清，用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)冲洗4～5次，再用乙醇梯度脱水，将处理好样品置于硅片上，室温干燥后，用离子溅射镀膜仪喷金，在扫描电镜Nova NanoSEM 230中进行观察，拍照。

2 结果

2.1 小菜蛾溶菌酶基因克隆和序列分析

RACE扩增的5′端与3′端分别出现单一条带，与预期结果大小相近，表明扩增获得小菜蛾溶菌酶基因5′端和3′端的产物。基于扩增得到的5′端和3′端产物进行回收测序，并利用SeqMan进行序列拼接，结果显示成功克隆获得的小菜蛾溶菌酶基因，命名为Pxlys(GenBank登录号：MN702780)，开放阅读框长423 bp，编码140个氨基酸。Protparam分析结果表明该蛋白相对分子质量为15.79 kD，理论等电点是8.91。SignalP 4.1分析结果表明该蛋白有信号肽存在，且位于第19-20位氨基酸之间，该蛋白为分泌蛋白，而TMHMM预测结果显示该蛋白质不存在跨膜结构。

2.2 小菜蛾溶菌酶基因系统进化

序列比对(图1)和系统进化分析结果表明(图2)，Pxlys序列与棉铃虫Heliothisvirescens、家蚕Bombyxmori、大豆食心虫Leguminivoraglycinivorella和亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis等的溶菌酶序列都具有60%以上的一致性，与NCBI中小菜蛾溶菌酶序列具有100%的一致性，确定本研究所获得的基因Pxlys为小菜蛾溶菌酶基因。

图1 小菜蛾Pxlys与同源蛋白序列比对

图2 邻接法构建的基于氨基酸序列的小菜蛾Pxlys与同源蛋白的系统进化树(重复1 000次)

2.3 小菜蛾溶菌酶原核表达及纯化

重组工程菌大肠杆菌Origami 2(DE3)-pET-29a-Pxlys经IPTG诱导后，与未诱导的对照组(泳道1)相比较，诱导的样品(泳道2)约在19 kD出现目标条带，说明成功表达目标蛋白；从泳道3可看出蛋白液与镍柱较好地结合；经不同浓度的洗脱液洗脱(泳道4-7)，成功纯化目标蛋白(图3)。

图3 小菜蛾溶重组蛋白Pxlys的纯化

2.4 小菜蛾溶菌酶Pxlys的抑菌活性

结果表明，溶菌酶Pxlys对革兰氏阳性细菌停滞棒杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性细菌大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌均有明显的抑菌活性，对革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌也有抑菌活性(图4)；但溶菌酶对不同类型的细菌表现出不一样的抑菌活性，对革兰氏阳性细菌表现出的抑菌圈比对革兰氏阴性细菌的更大(表1；图4)；其中对停滞棒杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌这4种细菌的抑菌圈直径(分别为20.0±1.1, 19.0±0.5, 16.5±0.5和16.3±0.5 mm)与对革兰氏阴性细菌的相比均表明溶菌酶Pxlys对这4种细菌表现出较强的抑菌作用。

表1 小菜蛾溶菌酶重组蛋白Pxlys(2.5 mg/mL)的抑菌活性

图4 小菜蛾重组溶菌酶蛋白Pxlys(2.5 mg/mL)的抑菌效果

采用液体生长抑制法测定重组小菜蛾溶菌酶蛋白Pxlys对2种革兰氏阳性细菌和1种革兰氏阴性细菌的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明，Pxlys对停滞棒杆菌的最小抑菌浓度为50 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为64 μg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为100 μg/mL。

用重组Pxlys分别处理停滞棒杆菌和大肠杆菌，以不加Pxlys为对照组，分别收集对应的菌体，在扫描电镜下进行观察结果显示，未经Pxlys处理的对照组，正常的停滞棒杆菌呈短棒状，细胞的表面完整、光滑，细胞形态没有发生改变,且未见细胞壁或细胞膜发生损伤(图5: A)；而在50 μg/mL Pxlys处理后，停滞棒杆菌细胞的形态发生了明显的变化，细胞表面损伤,细胞出现裂痕，进而导致细胞断裂，细胞内容物泄露(图5: B，红色箭头所示)；在更高浓度200 μg/mL Pxlys处理后，细菌的完整结构遭到严重破坏,细胞表面粗糙不平，细胞破裂,出现大量的细胞碎片，细菌死亡，其中部分细胞出现细胞骨架崩塌现象(图5: C，红色箭头所示)。未经过Pxlys处理的对照组，正常的大肠杆菌呈长杆状，细胞的结构完整,菌体饱满、表面光滑,未见细胞壁或细胞膜损伤(图5: D)；经100 μg/mL Pxlys处理后，细胞肿胀、凸起，细胞发生明显损伤，细胞表面不再完整,出现裂痕，小部分内容物流出(图5: E，红色箭头所示)；经更高浓度(400 μg/mL)Pxlys处理后，细胞结构遭到严重破坏，细胞出现不同程度涨破，大量胞浆内容物流出，最终导致细菌死亡(图5: F，红色箭头所示)。

3 讨论

本研究通过RACE技术从小菜蛾中克隆获得一条溶菌酶基因序列，命名为Pxlys。抑菌试验表明，重组Pxlys对停滞棒杆菌的最小抑菌浓度最小，对其抑菌活性最大；其次对金黄色葡萄球菌的抑菌作用也大于对大肠杆菌的抑菌作用(图4; 表1)，也进一步说明，重组小菜蛾溶菌酶不仅对革兰氏阳性细菌有抑菌能力，对革兰氏阴性细菌也具有一定的抑菌作用，并且小菜蛾溶菌酶对革兰氏阳性菌表现出比对革兰氏阴性菌更强的抑菌能力。抑菌分析表明，Pxlys表现出了广谱的抗菌活性，说明溶菌酶在昆虫先天性免疫抵御病原菌入侵中起着重要作用。同时也为生物防治小菜蛾提供了理论基础。研究表明，溶菌酶主要是通过破坏细菌的细胞壁来起到抗菌作用，因此其对革兰氏阳性菌比对革兰氏阴性菌具有更强的抗菌活性。为了探明小菜蛾溶菌酶对革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的作用机制是否存在差异，我们通过扫描电镜观察Pxlys处理待测菌后细胞的形态变化来初步探究Pxlys抑菌作用的机理。扫描电子显微镜下，经Pxlys处理过的停滞棒杆菌和大肠杆菌的溶菌特征不同(图5)，表明Pxlys对于这两种细菌有不同的抑菌机理。

前期研究表明，溶菌酶是一种阳离子抗菌肽(Sowa-Jasileketal., 2014)，它能够在带负电荷的细菌细胞膜中插入并成孔(Derdeetal., 2013; Hukietal., 2017)。多数研究表明，溶菌酶水解细菌的作用是由其作为肽聚糖水解酶来发挥作用的，使得细菌由于细胞壁出现裂痕，导致胞浆内容物泄露，最终导致细菌死亡(Brottetal., 2019)。尽管革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌结构存在差异，但Pxlys对其均有抑菌活性，那么对这两种细菌的抑菌作用方式是否存在差异呢？为了阐明小菜蛾溶菌酶抗菌机制，本研究采用扫描电镜技术，从细胞超微结构的角度来分析其抗菌机制。电镜结果显示(图5)，正常的停滞棒杆菌细胞结构完整，而经Pxlys处理过的停滞棒杆菌，其细胞边缘粗糙、外形不平，细胞出现裂痕，细胞骨架崩塌，出现大量的细胞碎片；与大肠杆菌的细胞肿胀、凸起进而导致细胞涨破不同，提示Pxlys对停滞棒杆菌与大肠杆菌的抑菌机理不同。前期研究认为，溶菌酶对革兰氏阳性细菌的抗菌作用主要是通过破坏细菌细胞壁的结构来起到杀菌作用，而溶菌酶对革兰氏阴性细菌的抗菌作用可能涉及到膜的破坏，增强了膜的通透性(Derdeetal., 2013)。虽然该机制较好地解释了小菜蛾溶菌酶对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌作用效果的不同，但该机制仍需后续进一步深入的研究。