L-赖氨酸调控球霰石碳酸钙结晶研究

任丽英 ，徐衡，李倩倩，王坤，马允

(1.安庆医药高等专科学校 药学系，安徽 安庆 2410522.功能配合物安徽省重点实验室 安庆师范大学 化学化工学院,安徽 安庆246001)

钙是生物体的微量元素，广泛分布在生物体内[1]，像脊椎动物的骨骼、软体动物的壳及哺乳动物的牙齿等的主要无机成分亦是钙盐.研究表明，碳酸钙是一种生物相容性好的药物载体材料，具有pH刺激响应性、可降解性、形貌可控等优点[2-4].由于尺寸效应和细胞吞噬作用，碳酸钙的形貌和尺寸是合成药物载体的关键，球霰石碳酸钙由于粒径分布均匀、分散性好、比表面积大、生物相容性和降解性好等优点，并且对正常细胞没有毒副作用，且具有良好的机械与热稳定性，是药物载体的首选.但球霰石碳酸钙不稳定[5]，易向更稳定的晶型转变，因此，研究制备过程中各种因素对碳酸钙晶型的影响，有助于筛选球霰石碳酸钙载体材料的制备条件.仿生合成是模拟生物矿化制备出人工晶体的方法，其中气相扩散法是最接近碳酸钙自然矿化制备过程，有利于研究碳酸钙的晶体生长机理，为模拟控制碳酸钙结晶提供实验及理论依据.在仿生合成碳酸钙的过程中，加入有机物作为无机矿物形成的基质，将合成条件确定后，无机粒子在基质上成核，无机矿物的整个生长过程中都受有机基质及其它给定仿生条件的调控，有利于碳酸钙晶体形貌和尺寸的观察.模板法分为硬模板和软模板两类.利用溶液中的粒子，如分子、粒子等通过化学键或分子间作用力形成晶体，并通过这些作用力影响和控制晶体的结晶和成核的方法叫做软模板法[6].常见的软模板粒子有生物小分子(糖类、氨基酸等)、无机分子或离子、有机物及各种高分子等.这些模板通过与碳酸钙的组成离子(钙离子或碳酸根离子)相互影响和作用，可实现对碳酸钙晶体的形貌、结构、成核及结晶过程的控制.在这些模板中，以生物分子为模板，调控碳酸钙晶体的形成过程，仿生合成具有不同结构和性能的碳酸钙微米材料更贴近生物体内碳酸钙的合成过程，利用这种方法不仅能合成出性能优越的材料，而且能够提供探讨生物矿化过程和机理体外模拟方法，进一步完善仿生合成的理论和实践，合成更多结构和功能的仿生材料[7].

赖氨酸具有L-型和D-型两种同分异构体.L-赖氨酸的有效成分含量一般为77%～79%，是人体必需氨基酸之一，生物学研究表明，血液中的多种纤溶活性的蛋白酶与L-赖氨酸有特异型相互作用，生物相容性好且利用率高[8].目前，采用气相扩散法以不同浓度的L-赖氨酸作为基质调控碳酸钙，制备球霰石微球的文献鲜有报道.实验选用L-赖氨酸作为软模板，采用气相扩散法仿生合成球霰石碳酸钙微球，在温度恒定，低于L-赖氨酸等电点的pH条件下成功制备出性质稳定的球霰石碳酸钙微球，结合实验过程与结果，探讨球霰石碳酸钙的可能形成机理.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

L-赖氨酸(分析纯(AR)，国药集团化学试剂有限公司)，氯化钙(AR，北京化学试剂公司)本实验所用其他试剂均是AR.实验用水均为二次蒸馏水.溶液的pH值由PHS-3C型pH计( 上海精科雷磁 )测定.在Nicolet Avatar 360型FT-IR上采集红外光谱数据，KBr压片，波数：分辩率3 cm-1，500-4000 cm-1,JEOL-7500B型场发射电子扫描电镜( SEM，日本JEOL公司 )在工作电压为5.0 kV条件下采集图片，以观测晶体微观形貌和结构.X射线粉末衍射测试是用日本岛津XRD-6000粉末X-射线衍射仪( Cu靶，Kα,λ=0.154060 nm ).

1.2 实验过程

在典型的实验中，将10 mL 10 mmol/L CaCl2(AR)加到小烧杯中，再加入0.7 g/L L-Lys，用氢氧化钠调节溶液的pH值至8.0.用保鲜膜密封小烧杯，之后用针在保鲜膜上扎3个小孔，轻轻将烧杯放入干燥器中(靠器壁摆放)，再取一小烧杯，加入分析纯的碳酸铵，同样用保鲜膜密封，并在保鲜膜上扎6-9个透气孔，处理好后放入上述干燥器的中央，然后将干燥器移至恒温(提前设好温度值恒定值25 ℃)培养箱中，在其他条件恒定下恒温静置24 h，即通过气相扩散法使试剂接触最终得到CaCO3亚微米粒.接着取出晶体，依次用用二次蒸馏水、无水乙醇洗涤3-5次，最后干燥晶体：取洗涤后的晶体至于常温条件下的电热恒温干燥箱内干燥1 d备用.

2 结果与讨论

2.1 不同L-Lys浓度条件下碳酸钙的结晶行为

图1给出4个具有代表性的CaCO3晶体颗粒的扫描电镜图.由图1可看出，L-Lys溶液的浓度变化时，CaCO3晶体颗粒的形貌也在发生明显的改变，可推出L-Lys的浓度对碳酸钙晶体的微观形貌有着十分明显的影响.图1a表征：L-Lys的浓度为0 g/L时，得到菱形的CaCO3晶体粒子，晶体颗粒均匀且呈现立方形貌，表面棱角分明；图1b表征：L-Lys的浓度为0.2 g/L时，CaCO3晶体出现透镜型和菱形；图1c：将L-Lys的浓度增大到0.4 g/L时，菱形碳酸钙粒子消失，全部转变成透镜形貌，从图中可得透镜形晶体粒径在2.5-4.5 μm之间.图1d：L-Lys浓度继续增大到0.7 g/L，出现椭圆球形碳酸钙晶体.

(a)纯水;(b) 0.2 g/L;(c) 0.4 g/L;(d) 0.7 g/L.图1 不同浓度L-Lys溶液中形成的CaCO3晶体扫描电镜图Fig.1 SEM images of CaCO3 particles obtained in the presence of different concentration L-Lys

2.2 FTIR与XRD分析

CaCO3存在3种稳定的晶型[1]：球霰石、文石及方解石，3种晶型的红外图谱不尽相同，均有独特的特征谱带.CaCO3晶体的方解石形貌FTIR谱带的特征峰在876 cm-1和712 cm-1处；876 cm-1和745 cm-1为球霰石形貌CaCO3粒子的特征峰；碳酸钙晶体的文石形貌晶体特征峰为856 cm-1和712 cm-1.图2是利用红外图谱表征在不同浓度的L-Lys溶液中所得的CaCO3晶体特征峰.从图2中可以看出，CaCO3晶体红外谱图的特征峰随着L-Lys溶液浓度改变而变化，结合扫描电镜图可知，CaCO3的晶体形貌同样因L-Lys溶液浓度的变化在逐渐改变.图2a是图1a所呈现的菱面体结构的碳酸钙中未加L-Lys溶液时得到的CaCO3的红外光谱图，由图2a可知876 cm-1、712 cm-1有吸收峰出现，可推得此菱形结构的CaCO3晶型为方解石型.图2b中，加入L-Lys的浓度为0.2 g/L，此时在745 cm-1出现了新的特征吸收峰，而原712 cm-1处的吸收峰没有消失，但强度减弱，可说明此时构成CaCO3的晶型有球霰石和方解石两种，这一结论可结合扫描电镜图(图1b)及XRD(图3a)共同得到结论.增大L-Lys的浓度至0.4 g/L时，只余下745 cm-1处的吸收峰(图2c)，712 cm-1处的特征峰基本消失，结合资料可推得碳酸钙的晶型为球霰石；当L-Lys的浓度增大到0.7 g/L，吸收峰同样分别在876 cm-1、745 cm-1处出现，表示得到的椭圆球体结构CaCO3的晶型仍为球霰石，这一结果同样被其XRD谱图所证实(图3b).综上：调整L-Lys溶液的浓度，制备出CaCO3晶体的不同晶型和形貌.

(a)纯水;(b) 0.2 g/L;(c) 0.4 g/L;(d) 0.7 g/L.图2 不同浓度L-Lys溶液中形成的CaCO3晶体的 傅立叶红外谱图Fig.2 FTIR spectra of CaCO3 particles obtained in the presence of different concentration L-Lys

(a) 0.2 g/L;(b) 0.7 g/L.图3 不同浓度L-Lys溶液中形成的CaCO3晶体的 X射线粉末衍射图Fig.3 XRD of CaCO3 particles obtained in the presence of different concentration L-Lys

2.3 不同浓度L-Lys溶液中CaCO3晶体的形成机理

在碳酸钙的众多晶型中，以方解石、文石和球霰石三种结晶最为常见.其中方解石和文石热力学稳定性好，无论在矿石中还是生物界都能稳定存在，因此在制备过程中，碳酸钙也容易转变为这两种晶型.由于球霰石处于热力学亚稳态，稳定性比方解石及文石略差，容易向着更稳定的晶型转变.在纯水中制备CaCO3时，沿着(104)晶面生长的碳酸钙热力学稳定性最佳，碳酸钙粒子优先沿此方向生长，进而得到规则形状的菱面体CaCO3晶体[9].碳酸钙在沉积的过程中，优先生成的是亚稳态的晶型，然后再向更加稳定的相态转变，但是如果向该体系中添加控制剂，控制剂能够阻止晶型之间的转变，使其处在亚稳态的晶型上[10].本文以L-Lys作为控制剂仿生合成碳酸钙晶体.在CaCO3仿生合成过程中，碳酸铵能够分解出CO2，经保鲜膜小孔缓慢扩散，进入装有软模板及钙离子的L-Lys-氯化钙溶液中，碱性溶液中被吸收电离出CO32-，在L-Lys的调控下，CO32-与Ca2+于有机相界面处结合，在有机分子膜的包裹下形成了碳酸钙晶体离子.L-Lys 与Ca2+相互间存在静电作用，随着不同浓度的L-Lys加入，形貌与晶型随之发生改变.L-Lys 的等电点为9.49，实验的pH为8时，低于其等电点条件下，L-Lys可以电离出羧酸根负离子，同时可电离出氨基正离子，这种不平衡性可能是碳酸钙能够以球霰石亚稳态晶型存在、生长的因素之一[11].羧酸根离子与晶核之间存在强烈的静电作用，这可能是球霰石碳酸钙由透镜形貌长成微球形貌的原因，同样我们也认为N—H 和C—O键可形成氢键，结构沿着c轴生长成球霰石碳酸钙微球[12-16].

3 结 论

以上实验证明，L-赖氨酸对CaCO3的结晶过程有着十分明显的影响，采用简单易操作的气相扩散法，以不同浓度的L-赖氨酸有机生物小分子为添加剂，实现对碳酸钙晶体形成过程的调控，成功制备出了透镜、微球形貌的球霰石碳酸钙晶体.本研究涉及反应简单，易于操作，合成的产品晶型与形貌可控，这为碳酸钙晶型和形貌的控制合成提供一条简单易行的途径，为碳酸钙药物载体材料的制备提供了合成方法与条件.