牛蒡子苷对高糖诱导的视网膜神经节细胞凋亡和氧化损伤的影响

冯万国，徐昕涌，许慧

糖尿病是世界范围内发病率较高的疾病，而糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是常见的糖尿病损伤之一[1]。视网膜是人体代谢活动最为活跃的组织，其可以将光转化成为神经冲动，通过视神经传递到大脑[2]。视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）是视神经的重要组成部分，高糖刺激后的RGCs 出现氧化损伤和凋亡过度，高糖诱导RGCs损伤是DR 发生的重要原因[3]。牛蒡子苷是一个从牛蒡的成熟果实牛蒡子中提取出来的活性成分，有多重生物学作用，如抗炎、降血糖、调节免疫、抗肿瘤等[4]。研究[5]发现，牛蒡子苷具有改善糖尿病相关并发症的作用，能够缓解糖尿病肾组织损伤。牛蒡子苷治疗后的糖尿病大鼠视网膜以及视神经损伤得到明显改善[6]。现阶段对于牛蒡子苷对体外高糖诱导的RGCs 氧化损伤和细胞凋亡的作用仍不明确。本次体外实验建立高糖RGCs 损伤模型，明确牛蒡子苷对高糖诱导的RGCs 凋亡和氧化损伤的影响，以期为牛蒡子苷治疗DR 提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

RGCs-5（上海沪震生物科技有限公司）；牛蒡子苷（大连美仑生物技术有限公司）；SOD 活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；caspase-3 活性检测试剂盒（北京诺博莱德科技有限公司）；ROS 水平检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Lipofectamine 2000（美国invitrogen）；MDA 水平检测试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）；TLR4 抗体（美国Santa Cruz Biotechnology）；TLR4 过表达载体（pcDNATLR4）由和元生物技术(上海)股份有限公司构建。

1.2 分组及处理方法

将RGCs 细胞分成5 组，分别是对照组、高糖组、牛蒡子苷低剂量组(ARC-Ⅰ组)、中剂量组(ARC-Ⅱ组)、高剂量组(ARC-Ⅲ组)，其中高糖组、ARC-I 组、ARC-Ⅱ组、ARC-Ⅲ组细胞在培养时分别添加50 mmol/L 的葡萄糖，ARC-I 组、ARC-Ⅱ组、ARC-Ⅲ组依次添加牛蒡子苷浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL。对照组为空白对照。

1.3 MTT 实验检测细胞增殖

将RGCs 细胞接种到96 孔板内，按照对照组、高糖组、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ组分组方法处理细胞，放在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h，在每个孔内加入10 μL 的MTT 溶液，继续放在37℃孵育4 h。取出培养板，用移液枪把每个孔中的液体吸掉，再加入150 μL 的甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，反应10 min 后，观察结晶物溶解，用酶标仪测定光密度（optical density，OD）值，经过空白孔调零以后，以对照组细胞存活率为100%，分析其余各组细胞存活率。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

按照对照组、高糖组、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ组分组方法处理培养细胞48 h 以后，收集各组细胞，分别添加提前预冷以后的PBS 缓冲溶液将细胞洗涤3 次。每组收集约106 个细胞，用结合缓冲液将细胞悬浮以后，添加PI 以及Annexin V-FITC 溶液各5 μL，流式细胞仪检测细胞凋亡变化。

1.5 caspase-3 活性变化

按照对照组、高糖组、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ组分组方法处理培养细胞48 h 以后，收集各组细胞，用caspase-3 活性检测试剂盒检测细胞中caspase-3 的活性变化，步骤完全按照试剂盒操作说明进行，结果以对照组为参照，分析高糖组及ARC 3种浓度组细胞caspase-3 活性变化。

1.6 ROS、MDA、SOD 水平

按照对照组、高糖组、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ组分组方法处理培养细胞48 h 以后，收集各组细胞，用ROS 水平测定试剂盒、MDA 含量检测试剂盒、SOD 活性检测试剂盒分别测定细胞中ROS、MDA、SOD 水平，步骤完全按照试剂盒操作说明进行。ROS 水平检测结果以对照组为参照，分析高糖组及ARC 3 种浓度组ROS 水平变化。

1.7 TLR4 蛋白表达

按照对照组、高糖组、ARC-Ⅰ、ARC-Ⅱ、ARC-Ⅲ组分组方法处理培养细胞48 h 以后，收集各组细胞，添加含有PMSF 的RIPA 裂解试剂，放在冰上裂解20 min 以后，收集细胞裂解溶液，12,000 g 离心10 min，吸取上清即为细胞蛋白。用BCA 方法测定细胞蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳用12%的分离胶以及5%的浓缩胶，在上样孔内添加蛋白样品50 μg，以80 V 的电压在浓缩胶中跑20 min，再以100 V 的电压在分离胶中跑1 h。切下分离胶，将PVDF 膜裁剪成合适大小，浸泡在甲醇中活化3 min，然后放在转膜缓冲液中结合5 min，设置100 mA 的电流转膜50 min。PVDF 膜放在封闭液（5%脱脂奶粉）中孵育1.5 h；再放在一抗稀释液中，在4℃孵育过夜；最后放在二抗稀释液中，在室温孵育1.5 h。用ECL 方法显色。扫描条带的灰度值，内参为GAPDH，分析目的蛋白TLR4 的表达变化。TLR4 一抗按照1:1,000 稀释，二抗按照1:4,000 稀释。

1.8 TLR4 过表达载体对细胞增殖、凋亡和ROS 水平作用检测

RGCs 中转染TLR4 过表达载体和空载体（NC）阴性对照，再用含有50 mmol/L 的葡萄糖、0.4 mg/mL的牛蒡子苷联合培养，分别记为ARC-Ⅱ+TLR4 和ARC-Ⅱ+NC 组，细胞转染按照Lipofectamine 2000转染试剂操作说明进行。细胞培养48 h 以后，MTT检测细胞增殖活性（步骤参照1.3），流式细胞术检测细胞凋亡（步骤参照1.4），试剂盒检测caspase-3 活性（步骤参照1.5）和ROS、MDA、SOD 水平（步骤参照1.6），Western blot 检测TLR4 蛋白表达（步骤参照1.7）。

1.9 统计学方法

采用软件SPSS21.0 进行统计分析。数据按照均数标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用方差分析中LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGCs 细胞增殖率和凋亡率比较

增殖率：5 组间比较，差异有统计学意义（F=78.63，P=0.000）。与对照组比较，差异均具有统计学意义（t高糖组=13.310，P=0.000；tARC-Ⅰ=9.785，P=0.000；tARC-Ⅱ=5.162，P=0.000；tARC-Ⅲ=1.640，P=0.121）。与高糖组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅰ=6.643，tARC-Ⅱ=10.880，tARC-Ⅲ=15.925，均P=0.000）。与ARC-Ⅰ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅱ=5.795，tARC-Ⅲ=10.812，均P=0.000）。与ARC-Ⅱ组比较，差异具有统计学意义（tARC-Ⅲ=15.925，P=0.000）（图1、表1）。

凋亡率：5 组间比较，差异有统计学意义（F=282.60，P=0.000）。与对照组比较，差异均具有统计学意义（t高糖组=29.123，tARC-Ⅰ=24.175，tARC-Ⅱ=24.748，tARC-Ⅲ=14.672，均P=0.000）。与高糖组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅰ=4.540，tARC-Ⅱ=12.009，tARC-Ⅲ=21.367，均P=0.000）。与ARC-Ⅰ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅱ=7.705，tARC-Ⅲ=16.314，均P=0.000）。与ARC-Ⅱ组比较，差异有统计学意义（tARC-Ⅲ=10.491，P=0.000）（图1、表1）。

图1 流式细胞术测定牛蒡子苷对高糖诱导的RGCs 凋亡影响。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低剂量组；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中剂量组；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高剂量组

表1 牛蒡子苷处理后的高糖条件下RGCs 增殖率、凋亡率以及caspase-3 活性变化（，n=9）

表1 牛蒡子苷处理后的高糖条件下RGCs 增殖率、凋亡率以及caspase-3 活性变化（，n=9）

注：* 与对照组比较，P＜0.05；# 与高糖组比较，P＜0.05；&与ARC-I 组比较，P＜0.05；▲与ARC-Ⅱ组比较，P＜0.05。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低剂量组；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中剂量组；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高剂量组；caspase-3 剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3

2.2 caspase-3 蛋白表达水平比较

5 组间比较，差异有统计学意义（F=410.90，P=0.000）。与对照组比较，差异均具有统计学意义（t高糖组=32.126，tARC-Ⅰ=24.371，tARC-Ⅱ=15.881，tARC-Ⅲ=8.199，均P=0.000）。与高糖组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅰ=12.640，tARC-Ⅱ=20.360，tARC-Ⅲ=25.989，均P=0.000）。与ARC-Ⅰ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅱ=9.161，tARC-Ⅲ=16.279，均P=0.000）。与ARC-Ⅱ组比较，差异具有统计学意义（tARC-Ⅲ=7.467，P=0.000）（表1、图1）。

2.3 ROS、MDA、SOD 水平比较

ROS 水平：5 组组间比较，差异有统计学意义（F=195.89，P=0.000）。与对照组比较，差异均具有统计学意义（t高糖组=25.564，tARC-Ⅰ=17.409，tARC-Ⅱ=14.698，tARC-Ⅲ=6.240，均P=0.000）。与高糖组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅰ=6.103，tARC-Ⅱ=12.481，tARC-Ⅲ=19.101，均P=0.000）。与ARC-Ⅰ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅱ=5.653，tARC-Ⅲ=12.219，均P=0.000）。与ARC-Ⅱ组比较，差异具有统计学意义（tARC-Ⅲ=7.972，P=0.000）（表2）。

表2 牛蒡子苷处理后的高糖条件下RGCs 的ROS、MDA、SOD 及TLR4 蛋白水平变化（，n=9）

表2 牛蒡子苷处理后的高糖条件下RGCs 的ROS、MDA、SOD 及TLR4 蛋白水平变化（，n=9）

注：* 与对照组比较，P＜0.05；# 与高糖组比较，P＜0.05；&与ARC-I 比较，P＜0.05；▲与ARC-Ⅱ比较，P＜0.05。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低剂量组；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中剂量组；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高剂量组；ROS 活性氧；MDA 丙二醛；SOD 超氧化物歧化酶；TLR4 Toll 样受体4

MDA 水平：5 组组间比较，差异有统计学意义（F=276.18，P=0.000）。与对照组比较，差异均具有统计学意义（t高糖组=25.468，tARC-Ⅰ=25.358，tARC-Ⅱ=17.985，tARC-Ⅲ=18.807，均P=0.000）。与高糖组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅰ=7.991，tARC-Ⅱ=13.309，tARC-Ⅲ=19.815，均P=0.000）。与ARC-Ⅰ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅱ=6.923，tARC-Ⅲ=16.259，均P=0.000）。与ARC-Ⅱ组比较，差异具有统计学意义（tARC-Ⅲ=8.341，P=0.000）（表2）。

SOD 水平：5 组组间比较，差异有统计学意义（F=273.88，P=0.000）。与对照组比较，差异均具有统计学意义（t高糖组=22.891，tARC-Ⅰ=17.698，tARC-Ⅱ=10.224，tARC-Ⅲ=4.510，均P=0.000）。与高糖组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅰ=19.128，tARC-Ⅱ=28.021，tARC-Ⅲ=29.600，均P=0.000）。与ARC-Ⅰ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅱ=14.773，tARC-Ⅲ=20.215，均P=0.000）。与ARC-Ⅱ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅲ=8.093，P=0.000）（表2）。

2.4 TLR4 蛋白表达比较

5 组组间比较，差异有统计学意义（F=149.90，P=0.000）。与对照组比较，差异均具有统计学意义（t高糖组=17.441，tARC-Ⅰ=14.000，tARC-Ⅱ=8.485，tARC-Ⅲ=4.160，均P=0.000）。与高糖组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅰ=6.240，tARC-Ⅱ=12.075，tARC-Ⅲ=16.128，均P=0.000）。与ARC-Ⅰ组比较，差异均具有统计学意义（tARC-Ⅱ=7.200，tARC-Ⅲ=12.746，均P=0.000）。与ARC-Ⅱ组比较，差异具有统计学意义（tARC-Ⅲ=5.824，P=0.000）（表2、图2）。

图2 Western blot 检测牛蒡子苷对高糖条件下RGCs 中TLR4 蛋白表达影响。ARC-Ⅰ牛蒡子苷低剂量组；ARC-Ⅱ牛蒡子苷中剂量组；ARC-Ⅲ牛蒡子苷高剂量组；TLR4 Toll 样受体4；GAPDH 甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2.5 TLR4 过表达载体对牛蒡子苷影响高糖条件下RGCs 中TLR4 蛋白表达作用

在RGCs 中转染TLR4 过表达载体，经过高糖和牛蒡子苷处理后，差异均具有统计学意义（t=9.391，P=0.001）（表3、图3）。

图3 Western blot 检测TLR4 过表达载体转染后对牛蒡子苷影响高糖条件下RGCs 中TLR4 蛋白表达作用。ARC-Ⅱ+NC 牛蒡子苷中剂量组+空载体；ARC-Ⅱ+TLR4 牛蒡子苷中剂量组+过表达TLR4；TLR4 Toll 样受体4；GAPDH 甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2.6 TLR4 过表达载体对牛蒡子苷影响高糖条件下RGCs 增殖率、凋亡率及ROS、MDA、SOD 水平比较

在RGCs 中转染TLR4 过表达载体，经过高糖和牛蒡子苷处理后，ARC-Ⅱ+NC 与ARC-Ⅱ+TLR4比较，细胞增殖率（t=7.639，P=0.000），凋亡率（t=7.129，P=0.000）和caspase-3 活性（t=8.231，P=0.000），ROS水平（t=13.891，P=0.000）和MDA 水平（t=8.406，P=0.000），SOD 活性（t=9.966，P=0.000），差异均具有统计学意义（表3、图4）。

图4 流式细胞术测定TLR4 过表达载体转染后对牛蒡子苷影响高糖条件下RGCs 凋亡影响。ARC-Ⅱ+NC 牛蒡子苷中剂量组+空载体；ARC-Ⅱ+TLR4 牛蒡子苷中剂量组+过表达TLR4

表3 TLR4 过表达载体转染后对牛蒡子苷影响高糖条件下RGCs 增殖率、凋亡率、caspase-3 活性和ROS、MDA、SOD 及TLR4 水平变化（，n=9）

表3 TLR4 过表达载体转染后对牛蒡子苷影响高糖条件下RGCs 增殖率、凋亡率、caspase-3 活性和ROS、MDA、SOD 及TLR4 水平变化（，n=9）

注：* 与ARC-Ⅱ+NC 比较，P＜0.05。ARC-Ⅱ+NC 牛蒡子苷中剂量组+空载体；ARC-Ⅱ+TLR4 牛蒡子苷中剂量组+过表达TLR4；TLR4 Toll样受体4；caspase-3 剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3；ROS 活性氧；MDA 丙二醛；SOD 超氧化物歧化酶

3 讨论

视网膜的内层结构是由RGCs 之间相互镶嵌而构成，RGCs 的轴突集合形成视神经[7]。DR 发生的重要原因之一是RGCs 损伤。高糖条件下，RGCs 内的抗氧化酶SOD 活性降低，细胞内的ROS 不能被及时清除而聚集在细胞内，这些ROS 可以将脂质过氧化，产生大量的MDA，造成氧化损伤[8]。另外，ROS 还可以诱导细胞凋亡发生，其诱导细胞凋亡发生的途径与caspase 有关[9]。caspase 家族含有多个成员，这些蛋白家族成员活性升高后可以诱导细胞凋亡的发生[10]。caspase-3 是caspase 蛋白家族的成员之一，位于凋亡反应的下游，其活性升高被认为是细胞凋亡发生的标志[11]。本实验结果显示，高糖处理后的RGCs 活性降低，细胞凋亡率和caspase-3 活性升高，细胞中ROS 水平及MDA 水平也升高，SOD 活性下降，提示高糖诱导RGCs 氧化损伤和细胞凋亡，这与上述研究结果一致，提示成功构建了体外高糖RGCs 损伤模型。

牛蒡子是我国的常见中药，牛蒡子苷是其主要的活性成分之一，具有消炎、抗病毒、改善尿蛋白等功效[12-14]。研究[15]报道表明，牛蒡子苷对于糖尿病具有一定的治疗作用，牛蒡子苷处理后的糖尿病肾病大鼠肾组织病变明显减轻。还有研究[6]显示，牛蒡子苷可以改善DR，牛蒡子苷灌胃处理后的糖尿病大鼠视网膜形态、厚度等发生明显变化。本次的实验显示，牛蒡子苷处理可以提高高糖条件下的RGCs活性，减少细胞凋亡，降低细胞中ROS 和MDA 水平，提高SOD 活性，说明牛蒡子苷抑制高糖诱导的RGCs 氧化损伤和细胞凋亡，提示牛蒡子苷有改善DR 的作用。

实验结果还显示，高糖处理后的RGCs 中TLR4蛋白表达水平升高，并且牛蒡子苷可以减少TLR4的表达，提示牛蒡子苷的作用机制可能与TLR4 有关。TLR4 是一个在哺乳动物中能够将细胞外的抗原信息识别并传递至细胞内的跨膜蛋白，参与组织炎症、细胞凋亡、细胞生长、组织代谢等多种生理过程[16-19]。研究[20]表明，糖尿病RGCs 中TLR4 过度表达，抑制TLR4 可以减少高糖诱导的RGCs 损伤。本实验表明，过表达TLR4 可以逆转牛蒡子苷对高糖诱导的RGCs 氧化损伤和凋亡的抑制作用，提示牛蒡子苷通过降低TLR4 的表达发挥高糖RGCs 损伤保护作用。

综上，牛蒡子苷在糖尿病视网膜损伤中可能发挥保护作用，其可以抑制高糖诱导的RGCs 氧化损伤和细胞凋亡，作用机制与下调TLR4 的表达有关。本次的实验结果为牛蒡子苷治疗糖尿病视网膜损伤提供了参考，为研究牛蒡子苷在DR 中的作用机制提供了理论资料。