高效液相色谱法同时测定寒热痹颗粒中5 种成分含量*

刘天竹 ，李成森 ，刘博琳 ，李 虹 ，周春玲 △

（1. 辽宁省检验检测认证中心·辽宁省药品检验检测院，辽宁 沈阳 110000； 2. 中国医科大学药学院，辽宁 沈阳 110000）

寒热痹颗粒由桂枝、防风、知母、白芍、麻黄、附子、白术、干姜、地龙、甘草组方，具有散寒清热、和营定痛功效，用于肌肉关节疼痛，局部触之发热，自觉怕冷畏寒，或虽触之不热但自觉发热，全身热象不显，以及风湿和类风湿关节炎见上述证候者。现行标准 WS3－B－3104－98 收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第十六册）》，无含量测定项［1］。方中，桂枝发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气［2］288；防风祛风解表，胜湿止痛，止痉［2］156；知母清热泻火，滋阴润燥［2］222；白芍养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳［2］108。为更全面地控制寒热痹颗粒的质量，参考文献［3－5］，分别选取上述4 味药材中相关活性成分进行含量测定，建立了可同时测定寒热痹颗粒中芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和芍药苷5种成分含量的高效液相色谱（HPLC）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC －2010A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有四元泵；Auto science 10200AD 型超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，功率为280 W，频率为40 kHz）；TU－1950 型分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；Sartorius BSA 224S－CW 型电子天平（精度为万分之一），Sartorius CP225D 型电子天平（精度为十万分之一），均购于德国赛多利斯公司。

1.2 试药

芒果苷对照品（批号为111607－201503，纯度为98.4%），升麻素苷对照品（批号为 111522 －201511，纯度为94.8%），5－ O－甲基维斯阿米醇苷对照品（批号为 111523－201610，纯度为 96.1%），肉桂酸对照品（批号为110786－201604，纯度为98.8%），芍药苷对照品（批号为 110736－201943，纯度为 95.1%），均购于中国食品药品检定研究院；寒热痹颗粒（辽宁上药好护士药业＜集团＞有限公司，规格为每袋10 g，批号分别为20191101，20190302，20190903，20190602，20181005，20180701，201803030，20171203，20171202，20171001）；乙腈（美国天地有限公司），磷酸（国药集团化学试剂有限公司，批号为T20090710），均为色谱纯；水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18柱（250 mm ×46 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）－ 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（程序见表 1）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：10.0 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液制备

取芒果苷对照品、升麻素苷对照品、5－ O－甲基维斯阿米醇苷对照品、肉桂酸对照品、芍药苷对照品各适量，精密称定，加入70%甲醇，分别制成每1 mL 含芒果苷 101.9 μg、升麻素苷 193.2 μg、5 － O － 甲基维斯阿米醇苷 191.2 μg、肉桂酸 197.6 μg、芍药苷 1.977 mg 的混合对照品贮备液，以及每1 mL 含芒果苷10.19 μg、升麻素苷 19.32 μg、5 － O－甲基维斯阿米醇苷 19.12 μg、肉桂酸 19.76 μg、芍药苷 0.197 7 mg 的混合对照品溶液。取装量差异项下样品适量，混匀，研细，取样品粉末5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为280 W，频率为45 kHz）30 min，放冷，称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得供试品溶液。分别按处方比例和制备工艺制备不含知母、白芍、防风、桂枝的阴性样品，按供试品溶液制备方法分别制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取上述混合对照品溶液、供试品溶液和4 种阴性对照品溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。理论板数按肉桂酸峰计应不低于5 000。结果供试品溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱峰相应位置上有相同的色谱峰出现，且各阴性对照均无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.mangiferin 2.paeoniflorin 3.cimicifugin 4.5 － O － methylvisamminoside 5.cinnamic acidA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Paeonia lactiflora D.Negative reference solution lacking Cinnamomum cassia E.Negative reference solution lacking Anemarrhena asphodeloides F.Negative reference solution lacking Saposhnikovia divaricateFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取对照品贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，10.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，取2.2 项下混合对照品溶液各5 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定。以进样质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。详见表2。

表2 各成分线性关系考察及检测限与定量限测定结果（n ＝6）Tab.2 Results of linear relation test，LOD and LOQ of each components（n ＝ 6）

检测限与定量限确定：精密吸取混合对照品溶液5.0 mL，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，作为检测限测定所用对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液20.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加 70%甲醇，作为定量限测定所用对照品溶液。按2.1 项下色谱条件分别进样测定，结果见表2。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1 项下色谱条件重复进样测定6 次，记录色谱图。结果见表3，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为20190602）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，分别于配制后0，4，8，12，16，24 h 时按 2.1 项下色谱条件进样测定。结果见表 3，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取样品（批号为20190602）适量，精密称定，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按2.1 项下色谱条件下进样测定。结果见表3，表明方法重复性良好。

表3 精密度、稳定性及重复性试验结果（n ＝6）Tab.3 Results of the precision，stability and repeatability tests（n ＝6）

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20190602）2.5 g，共 6 份，精密称定，依法制备供试品溶液，分别精密加入对照品溶液（芒果苷0.203 7 mg／mL、升麻素苷 0.772 8 mg ／ mL、5 － O － 甲基维斯阿米醇苷 0.478 0 mg／mL、肉桂酸 0.592 8 mg／mL、芍药苷5.931 9 mg／mL）各 1 mL，蒸干，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表4。

表4 各成分加样回收试验结果（n ＝6）Tab.4 Results of the recovery test of each component（n ＝ 6）

2.4 样品含量测定

取10 批样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别进样测定3 次，记录色谱图，按外标法分别计算芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和芍药苷的含量。结果见表5。

表5 样品含量测定结果（mg，n ＝3）Tab.5 Content determination of five components in the samples（mg，n ＝ 3）

3 讨论

取芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和芍药苷对照品，分别加甲醇溶解，分别于200 ～400 nm 波长范围内扫描，5 种成分的最大吸收波长分别为 258，254，254，285，230 nm。升麻素苷和 5 － O－甲基维斯阿米醇苷的最大吸收波长均为254 nm，且其他成分在该波长处均有较好吸收，故选择254 nm 为测定波长。

按拟订色谱条件，考察了不同品牌色谱柱［Shiseido Capcell PAK C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Waters Sunfire C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）和 Aglient SB C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）］对含量测定结果的影响。结果表明，各种不同品牌色谱柱均可使样品有效分离，各种成分的理论板数、分离度、对称因子等均符合要求。

考察了不同流动相及其比例（甲醇－0.1%磷酸水溶液和乙腈－0.1%磷酸水溶液）下色谱峰出峰顺序的不同，根据各成分的分离情况，最终选定乙腈－0.1%磷酸水溶液为测定用流动相。不同品牌的色谱柱和不同流动相组成，色谱峰均能有效分离，表明方法耐用性良好。

综上所述，本研究中建立的方法简便、可靠，专属性强，准确度高，重复性好，可用于同时测定寒热痹颗粒中芒果苷、升麻素苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷、肉桂酸和芍药苷5 种成分的含量，可供产品质量控制提供参考。