褐藻胶裂解酶研究进展

2021-08-15吴阳霍峥李刚温少红

食品工业 2021年7期

吴阳，霍峥，李刚，温少红

烟台大学生命科学学院（烟台 264000）

褐藻胶存在于褐藻细胞壁及细胞间质中，约占其干重的40%。褐藻胶是酸性阴离子线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate；M）和与其C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronate；G）通过1,4糖苷键共价连接，以均聚或随机的方式排列成同源多糖醛酸M残基（Poly M）、G残基（Poly G）以及杂多糖醛酸（Poly MG或Poly GM）[1]。除褐藻外，褐藻胶也由两个细菌属——固氮菌（例如葡萄固氮菌Azotobactersp.）和几种假单胞菌产生（例如铜绿假单胞菌Pseudomonosasp.）。

褐藻寡糖（AOS）由褐藻胶降解产生，除保留褐藻胶的优良特性外还具有特殊的化学特性及生物活性，具有更广泛的应用价值。在食品方面作为食品添加剂，农业方面作为植物生长促进剂和治疗剂，医药方面具有抗氧化和抗肿瘤等特性，在能源方面将褐藻胶降解为寡糖是将其直接转化为乙醇的关键步骤[2-5]。

褐藻胶的降解方法有物理法、化学法和酶解法。酶解法具有底物专一、反应条件温和等优点，还可以定向制备褐藻寡糖，相较于物理、化学法是一种理想且环保的方法。但是褐藻胶裂解酶的应用目前仍处于研究阶段，无法投入工业大规模生产。

1 褐藻胶裂解酶的来源

迄今为止，许多褐藻胶裂解酶已被鉴定、基因克隆和纯化，其来源多种多样，例如从海带、马尾藻、土壤中分离得到的海洋和陆地细菌、真菌、噬菌体和病毒（小球藻病毒）等，以褐藻为食的海洋软体动物（鲍鱼Haliotis spp.、海兔Aplysia kurodai、短滨螺Littorina brevicula等）的肠道中也存在着褐藻胶裂解酶。特别地，Stender等[6]从人肠道细菌—溶胞拟杆菌中分离得到褐藻胶裂解酶BeclPL6。

目前对细菌产的褐藻胶裂解酶的研究较为广泛和深入，已鉴定出50000多个褐藻胶裂解酶氨基酸序列，其中47000个属于细菌基因组，包括弧菌属Vibriosp.[7-8]、吞噬性去氟弧菌Defluviitalea phaphyphila[9]、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonassp.[10]、铜绿假单胞菌属Pseudomonas aeruginosa[11]、卡拉胶假单胞菌属Pseudoalteromonas carrageenovora[12]、芽孢杆菌属Paenibacillus[13]、溶胞拟杆菌Bacteroides cellulosilyticus[6]、微鳞球菌Microbulbifersp.[14-16]、志贺氏菌Shewanellasp.[17]、嗜盐白蚁菌Zsoptericola halotoleransWX[18]等。

2 褐藻胶裂解酶的作用方式

褐藻胶裂解酶通过β-消除的酸碱催化作用，以1,4O-糖苷键为目标，将褐藻胶降解为带有不饱和双键的寡糖，并在非还原末端形成不饱和残基，用符号Δ表示[19]。褐藻胶裂解酶的β-消除作用如图1所示。

图1 褐藻胶裂解酶的β-消除

Gacesa[20]提出了一种褐藻胶裂解酶的新的催化假说，描述了β-消除反应的三个步骤：（1）去除羧酸盐阴离子上的负电荷，通过盐桥（组氨酸和赖氨酸）中和电荷，降低H-5质子的pKa；（2）一般碱催化提取C-5上的质子，其中可能需要一个残基作为质子提取者，另一个作为质子供体或残基同时充当质子供体和受体，得到稀酸盐中间体；（3）羧基的电子转移导致C-4和C-5之间形成双键，并最终裂解O-糖苷键。

3 褐藻胶裂解酶的分类

3.1 根据分子量大小

根据分子质量，将褐藻胶裂解酶分为三类：第一类分子质量在20～35 kDa之间[13-14]；第二类分子质量约为40 kDa[21-22]；第三类分子质量约为60 kDa[10]。特别地，ZH0-Ⅰ分子质量为91 kDa，ZH0-Ⅳ分子质量为113 kDa[10]。

3.2 根据底物特异性

将褐藻胶裂解酶分为1,4-β-D-聚甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3），1,4-α-L-聚古罗糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11），以及在两者中均显示活性的双功能酶。目前已报道多种双功能裂解酶，Tavafi等[11]在铜绿假单胞菌中发现了既能降解Poly M，又能降解Poly G的双功能褐藻胶裂解酶。

3.3 根据作用方式

褐藻胶裂解酶可被分为内切酶和外切酶，外切酶也可称为寡褐藻胶裂解酶（EC 4.2.2.26）。迄今为止大部分褐藻胶裂解酶为内切酶，主要产物为不饱和寡糖（2-4糖）。不饱和寡糖无法直接转化为生物燃料，而外切褐藻胶裂解酶作用于褐藻胶或褐藻寡糖的非还原末端，释放出的不饱和残基DEH，可用作生物燃料[5]，生物燃料的生产突出了外切型褐藻胶裂解酶的意义。表1是近年发现的外切褐藻胶裂解酶。

表1 外切褐藻胶裂解酶

3.4 根据序列相似性

根据CAZy数据库（www.CAZy.org/olysaccharide-Lyases.html），褐藻胶裂解酶分为12个多糖裂解酶家族（PLs），包括PL5，PL6，PL7，PL14，PL15，PL17，PL18，PL31，PL32，PL34，PL36和PL39。Helbert等[29]研究表明，PL32，PL34和PL36是新建立的，PL36包括39个细菌序列和一个真菌序列[30]。Ji等[9]从Defluviitalea phaphyphilaAlg1中分离出新的PL39家族的褐藻胶裂解酶。

大多褐藻胶裂解酶属于PL-5和PL-7家族，且多为Poly M裂解酶。但PL-7家族中也包含一部分Poly G裂解酶，对于重组酶Aly1281[12]，Poly G的裂解优于Poly M。近年来PL-6家族的褐藻胶裂解酶也被广泛分离出来。PL-6家族中多为Poly G裂解酶，例如Lyu等[8]从弧菌OU02中分离出的第一个单域结构的褐藻胶裂解酶AlyF是Poly G裂解酶。但也有例外，如SHA-4是PL6家族中第一个对PolyMG有底物偏好性的外切型褐藻胶裂解酶[26]，BeclPL6[6]为Poly M褐藻胶裂解酶。

3.5 根据折叠类型

褐藻胶裂解酶可分为3个折叠类型：β-jelly roll class（PL7，PL14，PL18和PL36）、（α/α）n环折叠（PL5，PL15和PL17）和β-螺旋（PL6）[31]。AlgNJU-03[7]及Aly36B[30]分别属于PL-7和PL-36家族，结构均为β-jelly roll。PL6家族的PsAly[13]及BeclPL6[6]均为β-螺旋结构。

4 褐藻胶裂解酶的酶活测定方法

4.1 初筛——平板测定法

以褐藻胶为唯一碳源，对褐藻胶裂解酶进行定性筛选，包括乙醇法、碘液法、CaCl2法、十六烷基氯化吡啶（CPC）等，未被水解的底物会被染色或形成白色沉淀。

Sawant等[32]首次提出用革兰氏碘代替CPC：革兰氏碘2～3 min即可清楚形成对比区域，而CPC法至少需要30～40 min，且培养基中的琼脂会干扰CPC的作用。因此革兰氏碘是目前使用平板筛选褐藻胶裂解酶产生菌的最佳方法。

4.2 复筛

复筛即定量测定，包括紫外吸光光度法[33]、硫代巴比妥酸法（TBA法）[24]、3,5-二硝基水杨酸法（DNS定糖法）、黏度法等。魏丹等[18]提出了改良版的DNS法，采用0.1 mL酶与1 mL底物反应，沸水灭活3 min，该方法可以减少发酵液中原本的还原糖对显色的影响。近年来紫外法及DNS法应用较为广泛，但因试验条件的不确定性以及酶活单位定义的不同，各种测定方法之间还无法完全进行比较。

5 菌株产酶酶活的提高

对发酵条件的优化可以提高菌株产酶酶活。例如菌株大多需要褐藻胶诱导产酶；海洋细菌对NaCl含量要求较高，且大多褐藻胶裂解酶对Na+具有依赖性；另外金属离子对酶与底物结合时的电荷有影响，使得部分金属离子对酶活具有促进或抑制作用[18]。

由于部分野生菌的不稳定性以及酶活较低，对其进行编码重组可以获得更高酶活的褐藻胶裂解酶。Hu等[33]将Aly7B重组为Aly7B-CDⅠ和Aly7B-CDⅡ，仅Aly7B-CDⅡ具有褐藻胶裂解酶的酶活，且酶活提高了近6倍。Li等[22]将重组褐藻胶裂解酶AlyPL6固定在MTOP上，可以提高其热稳定性和重复利用性，使其在工业上得到更充分的应用。因此，在编码重组及固定化的基础上进行发酵条件的优化，可以得到更高酶活及优良生物活性的褐藻胶裂解酶。

6 褐藻胶裂解酶的酶学性质

不同的褐藻胶裂解酶的酶学性质不尽相同，对酶学性质的研究可以使酶发挥出最大潜力。

研究表明褐藻胶裂解酶最适温度范围为30～50℃，但也有例外，高杨等[21]从印度尼西亚的热泉样品中分离出的褐藻胶裂解酶AlyB5的最适温度为65 ℃，在70 ℃时仍保持75%以上的酶活；而Itoh等[13]克隆出的褐藻胶裂解酶PsAly的最适温度在67 ℃，在37 ℃保存24 h，酶活仍保留50%以上，随着温度升高，其半衰期的出现时间越短。

褐藻胶裂解酶的最适pH约为6.0-8.0，特别的，Li等[22]克隆出的AlyPL6的最适pH为10；严芬等[34]筛选的褐藻胶裂解酶的最适pH为5.5，偏酸性。

不同金属离子会对褐藻胶裂解酶的活性产生影响，少数几个在多金属离子条件下表现出高活性，还有部分受到某些金属离子的抑制作用。He等[10]在鞘氨醇单胞菌中分离克隆了3个内切酶及一个外切酶，Hg2+对这四种酶的活性均有促进作用，同时也存在其他金属离子对克隆出的4个酶有促进或抑制作用。AlgNJU-03的酶活在含有Ca2+、Fe2+或Co2+环境中提高，特别是Ca2+对其酶活促进作用最为明显[7]。Ca2+对较多的褐藻胶裂解酶的酶活具有促进作用，但也有例外，比如AlyF具有钙不依赖性[8]，Ca2+对Aly17B具有抑制作用[35]等。

Zhu等[14]从Microbulbifersp.ALW1中分离出的褐藻胶裂解酶在0.5 mol/L Na+作用下酶活提高5.1倍。重组酶Aly1281[12]具有明显的耐盐性，使其可以应用于褐藻的工业酶法加工而无需进行水密集的脱盐处理。

7 褐藻胶裂解酶的应用

褐藻胶裂解酶可应用于食品、农业、制药及能源等方面，其不仅可以降解褐藻胶，定向制备褐藻寡糖，也可用于阐明褐藻胶的细微结构、制备海藻原生质体、发酵生产乙醇、降解生物膜等。

7.1 功能性低聚糖的制备

褐藻胶内切酶是将褐藻胶生产为功能性低聚糖（2-5糖）的关键工具，不同聚合度的褐藻寡糖的应用也不尽相同。低分子质量（500～3000 Da）和较高的M/G比（＞1）的褐藻寡糖能更好地促进植物的生长[2]。Zhang等[3]和Zhu等[14]发现的褐藻胶裂解酶产的二糖均具有抗氧化活性。Chen等[4]分离出4个不同聚合度（DPs）的寡糖，但在这些寡糖中仅五糖对骨肉瘤细胞显示抗肿瘤功能。

7.2 褐藻胶精细结构的阐明及海藻原生质体制备

褐藻胶裂解酶也可用于分析或修饰褐藻胶的精细结构。Aarstad等[1]采用H-1 NMR，HPAEC-PAD和SEC-MALLS等方法分析降解的反应产物和分离的褐藻胶片段，实现褐藻胶的测序。褐藻胶裂解酶也可以制备藻类的原生质体，应用于基因工程和获得再生植株。Inoue等[36]发现褐藻胶裂解酶可以分解凝胶结构，进而有效地从日本粳稻叶片中分离出原生质体。

7.3 发酵生产乙醇

褐藻胶作为生产生物乙醇的可再生资源，已引起越来越多的关注。褐藻胶、甘露醇和葡萄糖的分解代谢产生了丙酮酸盐，可以从中合成大量的燃料，Wargacki等[5]建立了生产乙醇的微生物平台，其产量可以达到理论值的80%。目前仅在实验室条件下采用工程菌株生产乙醇，还无法完全应用于工业生产。

7.4 生物膜的降解及囊性纤维化的治疗

褐藻胶裂解酶能够降解细菌分泌的褐藻胶形成的生物被膜，增强抗生素的渗透性。部分抗生素（妥布霉素、头孢克肟）与褐藻胶裂解酶具有协同作用，可以促进生物膜的根除，相反也有的抗生素（环丙沙星）与褐藻胶裂解酶的结合显示拮抗作用[11]。褐藻胶裂解酶在囊性纤维化的治疗中也显示出巨大的潜力，Wan等[37]创建了银纳米复合材料，递送两种药物化合物（褐藻胶裂解酶和头孢他啶）以降解褐藻胶并从肺部根除铜绿假单胞菌。