表面脱乙酰化魔芋葡甘聚糖的制备及吸附胆固醇能力

罗媛，罗立新，贾克寒

武汉大学化学与分子科学学院（武汉 430072）

随着社会的飞速发展，健康成为人们关注的重点，高血脂、高血压、高血糖等慢性病逐步普遍化和低龄化，传统药物大量服用又会带来不良反应，这促使人们在中国传统医学中寻求解决的方法。魔芋是一种具有巨大地下球茎的天南星科多年生草本植物，其球茎中主要成分为魔芋葡甘聚糖（KGM）。KGM的主链是由葡萄糖和甘露糖以1∶1.4/1∶1.6由β-1,4-糖苷键连接，甘露糖的C-3位置上以β-1,3键连接支链结构，每32个糖残基上有3个支链，平均每9～19个糖残基有1个乙酰基团[1-4]，乙酰基团赋予其溶解特性[5]。

KGM可以在肠道表面成膜，平衡肠道内糖类和油脂的吸收，也可通过裹挟或者吸附，减少肠道内对于糖类、脂质等物质的吸收利用，其被细菌分解产生的短链脂肪酸可以促进肠道蠕动。魔芋葡甘聚糖作为一种天然可溶性的膳食纤维，具有润肠通便[6]、平稳血糖[7]、降低胆固醇[8]、减肥降脂[9]等功效。在高血脂人群中的使用效果十分显著，孕妇和婴幼儿便秘等方面因其安全性也很受关注。但魔芋葡甘聚糖在水中会迅速溶解，快速凝胶化，且1%（W/W）KGM溶液黏度可达30000 cps[4]，造成难以服用的问题。KGM研究主要集中于交联后魔芋颗粒[10-11]、包埋魔芋颗粒[12]、复合膜[13]及魔芋葡甘聚糖酯化改性[14]等。利用简单的醇碱工艺在室温下脱除KGM颗粒表面的乙酰基，制备一种难溶或者不溶于水的表面脱乙酰化魔芋葡甘聚糖（SDa-KGM）。开展酶解试验及体外模拟吸附试验，探究SDa-KGM的生物降解性和对高血脂的代表物胆固醇的吸附作用。表面脱乙酰化魔芋葡甘聚糖解决魔芋葡甘聚糖人体食用的难题，并保留有魔芋葡甘聚糖的生物降解性和安全特性，在体重控制、“三高”控制、孕妇和儿童便秘等方面具有相当优势。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

魔芋精粉（武汉纤浓生物科技有限公司）；纤维素酶（浙江一诺生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

UV752紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；SHA-c数显水浴恒温振荡器（常州博远实验分析仪器厂）；JZ-2数显离心机（金坛市洪科仪器厂）；85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；FA2004B分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；101-3型干燥箱（中国上海市实验仪器总厂）；傅里叶红外光谱仪iS10（美国Thermo公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 表面脱乙酰化魔芋葡甘聚糖（SDa-KGM）制备

称取10.0 g魔芋精粉置于100 mL一定体积浓度的乙醇溶液中，在室温下（25 ℃）充分溶胀0.5 h，加入适量的氢氧化钠溶液，持续搅拌反应一段时间后，抽滤，用乙醇反复洗涤、浸泡颗粒至pH中性，将样品颗粒置于50 ℃烘箱中干燥至恒重，即得表面脱乙酰化魔芋葡甘聚糖产品颗粒，用SDa-KGM（乙醇体积浓度-NaOH量与KGM质量比-反应时间）来表示。

1.2.1.1 乙醇体积分数的影响

取10.0 g魔芋精粉分别加入到30%，40%，50%，60%和70%（V/V）乙醇的溶液中，溶胀充分后加入6 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，室温下反应1 h进行脱乙酰化处理。

1.2.1.2 氢氧化钠溶液添加量的影响

取10.0 g的魔芋精粉加入到40%乙醇的溶液中，溶胀充分后分别加入3.0，4.0，5.0，6.0和7.0 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液，室温下反应1 h进行脱乙酰化处理。

1.2.1.3 反应时间的影响

取10.0 g魔芋精粉加入到40%乙醇的溶液中，溶胀充分后加入6 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，室温下分别反应0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h进行脱乙酰化处理。

1.2.2 红外测试

样品采用KBr压片法，在400～4000 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.2.3 产品颗粒溶胀体积测定及结构特征

颗粒溶胀体积测定：称取10.000 g干燥的SDa-KGM固体粉末于100 mL具塞量筒中，加入100 mL去离子水使其溶胀，摇散使其溶胀均匀，静置30 min记录1次，直至溶胀体积稳定。

孔隙率及骨架密度测定：SDa-KGM用去离子水充分浸湿后，用滤纸吸干颗粒间的水分，测定样品的湿重（Ww，g）和体积（V，mL）。将样品分别用乙醇、丙酮和乙醚反复多次洗涤，在50 ℃烘箱中干燥至恒重，测量样品的干重（Wd，g）。固体试样的骨架密度（ρg，g/mL）、平均孔容量（Vp，mL/g）和孔隙率（Pr，%）按式（1）～（3）计算。

1.2.4 SDa-KGM生物降解性

取0.050 g KGM/SDa-KGM于25 mL 4 g/L纤维素酶溶液中，在50 ℃水浴恒温振荡器中，分别反应20，40，60，80，100和120 min，在沸水浴中10 min终止酶反应。离心取1 mL上层清液，加入蒸馏水稀释，加入3 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂[15]，用752紫外分光光度计在500 nm处比色测定，以魔芋葡甘聚糖的含量表示KGM/SDa-KGM的水解程度。

1.2.5 SDa-KGM吸附胆固醇的等温吸附性能

称取一定量的表面脱乙酰化KGM加入到0.015，0.05，0.1，0.5，1.0，3和5 g/L的胆固醇溶液，在37 ℃水浴中振荡一定时间后，离心，取上层清液，采用GB/T 5009.128—2003《食品中胆固醇的测定》[16]测定胆固醇浓度，计算SDa-KGM的吸附容量以衡量SDa-KGM吸附能力。

1.2.6 SDa-KGM吸附胆固醇的动力学附性能

称取一定量的表面脱乙酰化KGM加入到3.0 g/L胆固醇溶液中，在37 ℃水浴中振荡一定时间后，离心，取上层清液，采用GB/T 5009.128—2003《食品中胆固醇的测定》[16]以测定胆固醇浓度，计算SDa-KGM的吸附容量以衡量SDa-KGM吸附能力。

2 结果与分析

2.1 合成条件对KGM表面脱乙酰化的影响

2.1.1 乙醇体积分数的影响

由图1（a）可知，3416.03 cm-1和870.49 cm-1处分别为KGM的缔合羟基伸缩振动吸收峰和β-D糖苷键特征吸收峰。在SDa-KGM红外图中这些特征峰明显存在，说明SDa-KGM依然保持KGM的一级主链结构。KGM红外图中1727.54 cm-1处代表乙酰基中—C＝O的伸缩振动吸收峰，说明KGM有乙酰基的存在。起始阶段随着乙醇体积分数增加，该吸收特征峰消失，乙醇体积分数30%～50%时，红外图谱中乙酰基的特征吸收峰完全消失。乙醇体积分数60%～70%时，乙酰基特征吸收峰重新出现。这是由于乙醇可以抑制KGM颗粒的溶胀，乙醇体积分数越大，KGM颗粒溶胀体积就越小，与碱接触的表面积也就越小，进而影响KGM与碱的脱乙酰化反应。

由图1（b）可知，10 g SDa-KGM干粉体积约10 mL，随着乙醇体积分数增加，每10 g SDa-KGM颗粒在水溶液中的溶胀体积也从48 mL逐步增大到76 mL。这是由于脱乙酰化程度的影响，葡甘露聚糖主链上的乙酰基赋予其溶解特性，脱乙酰化程度越高，颗粒表面分子链之间的交联就越紧密，SDa-KGM颗粒在水溶液中溶胀体积也就越小。

图1 不同乙醇体积分数影响下SDa-KGM的红外光谱图（a）和在水溶液中的溶胀体积（b）

2.1.2 氢氧化钠溶液添加量的影响

由图2（a）可知，随着1 mol/L氢氧化钠溶液体积增加，乙酰基的逐渐脱除。加入3～5 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液时，红外图中乙酰基的伸缩振动吸收峰逐渐消失，加入6 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液时，红外图中乙酰基的特征吸收峰完全消失。魔芋葡甘聚糖中的乙酰基是以酯键的形式连接在糖残基上，颗粒表面乙酰基的脱除实质是酯的水解，所以氢氧化钠溶液添加量的增加可以提高乙酰基的脱除程度。失去乙酰基的裸状魔芋葡甘聚糖由于分子之间形成氢键而产生部分结晶作用，以这种结晶为节点形成网状结构[19-20]而不溶于水。随着氢氧化钠溶液体积增加，SDa-KGM颗粒在水溶液中的溶胀体积先逐步减小后趋近不变，6 mL之后1 mol/L氢氧化钠溶液量继续加大，SDa-KGM颗粒在水中溶胀体积不再减小。

图2 不同碱体积影响下SDa-KGM的红外光谱图（a）和在水溶液中的溶胀体积（b）

2.1.3 反应时间的影响

由图3（a）可知，随着脱乙酰化时间延长，乙酰基逐步脱除。反应时间0.5 h时，红外图谱中还存在微弱的乙酰基的吸收峰。反应时间1.0 h时，乙酰基特征吸收峰完全消失。由图3（b）可知，随着反应时间延长，SDa-KGM颗粒在水溶液中的溶胀体积逐步减小后趋近平缓。反应时间0.5～1.0 h时，10 g SDa-KGM颗粒在水中溶胀体积从60 mL减小到54 mL，这与乙酰基的存在有关。反应时间1.0～2.5 h时，由于乙酰基特征吸收峰消失，SDa-KGM在水溶液中的溶胀体积不会随着反应时间延长而大幅下降。

图3 不同反应时间影响下SDa-KGM的红外光谱图（a）和在水溶液中的溶胀体积（b）

2.1.4 SDa-KGM的结构特征

分别在乙醇体积分数30%，40%，50%，60%，70%和90%制备结构特征不同的SDa-KGM。随反应条件乙醇体积分数增大，SDa-KGM产品颗粒在水溶液中的溶胀体积增大，孔隙率和孔容量也逐步增大，骨架密度逐步减小。可以通过改变制备工艺条件乙醇体积分数、加入NaOH的量、反应时间，合成不同结构特征的SDa-KGM产品。SDa-KGM（90-2.4%-1）颗粒在水溶胀体积最大到达7.10 mL/g，孔隙率为57.13%，孔容量达到6.777 mL/g，骨架密度为0.190 g/mL。如表1所示。

表1 不同乙醇体积浓度下产品结构特征

2.2 SDa-KGM生物降解性

如图4所示，其他制备条件一定，SDa-KGM（30-2.4%-1）在不同乙醇体积分数中交联最为紧密，水溶胀体积最小。纤维素酶水解SDa-KGM（30-2.4%-1）颗粒，开始酶解时，魔芋葡甘聚糖的百分含量随时间增长而增加，酶解时间40 min时，SDa-KGM（30-2.4%-1）酶解溶液中有极少漂浮未酶解的SDa-KGM颗粒，酶解时间60 min时，SDa-KGM（30-2.4%-1）酶解溶液基本到达澄清，几乎完全完成酶解。酶解时间60～80 min时，酶解的魔芋葡甘露聚糖含量基本稳定，其含量为62.15%。

图4 纤维素酶水解SDa-KGM和KGM

纤维素水解KGM趋势和SDa-KGM（30-2.4%-1）基本一致，KGM酶解时间为40 min时基本完成酶解，时间略早于SDa-KGM（30-2.4%-1）酶解。其到达最大酶解程度时，魔芋葡甘聚糖含量为61.75%。试验表明，纤维素水解SDa-KGM（30-2.4%-1）和KGM，魔芋葡甘聚糖含量均在62%左右，酶解程度基本一致，说明SDa-KGM（30-2.4%-1）还是保持KGM的生物降解性。SDa-KGM具有良好的生物降解性。

2.3 胆固醇等温吸附曲线

如图5所示，随着胆固醇起始质量浓度增加，3种SDa-KGM颗粒对于胆固醇的吸附容量先增大后减少。其中，胆固醇质量浓度3 g/L时，3种脱乙酰化程度不同的颗粒均到达最大吸附量，SDa-KGM（30-2.4%-1）的最大吸附量为83.1790 mg/g，SDa-KGM（50-2.4%-1）的最大吸附量为86.0690 mg/g，而SDa-KGM（90-2.4%-1）最大吸附量则到达100.5189 mg/g。3种SDa-KGM对胆固醇的吸附量存在差异，并且胆固醇的起始质量浓度对吸附容量的影响较大。胆固醇起始质量浓度低时，SDa-KGM对胆固醇的吸附量也较低，并且3种SDa-KGM颗粒对胆固醇的吸附量差别不大。胆固醇质量浓度小于1 g/L时，3种颗粒对胆固醇的吸附量基本接近，但胆固醇质量浓度达到3 g/L后，SDa-KGM（90-2.4%-1）颗粒对于胆固醇的吸附呈现出优势。

图5 SDa-KGM胆固醇等温吸附曲线

利用lnqe对lnCe拟合，图线性关系良好，SDa-KGM（90-2.4%-1）吸附胆固醇拟合式为lnqe=1.10468lnCe+3.14346，相关系数R=0.9855，符合Freundlich等温吸附模型，且吸附过程中脱乙酰化魔芋葡甘聚糖对胆固醇的吸附能力较强，属于不均匀表面吸附。

2.4 胆固醇动力学吸附曲线

3种表面不同程度脱乙酰化的魔芋葡聚糖颗粒在3 g/L胆固醇的冰乙酸溶液中振荡不同时间的吸附容量如图6所示。3种脱乙酰颗粒吸附胆固醇的速度较快，随着时间延长，吸附速率随时间延长而逐渐减小，并且基本在90 min时到达吸附平衡状态，SDa-KGM（30-2.4%-1）、SDa-KGM（50-2.4%-1）、SDa-KGM（90-2.4%-1）吸附胆固醇到达平衡时的吸附容量分别为80.2890，83.1790和103.5189 mg/g。SDa-KGM对胆固醇具有良好的吸附能力。随孔隙率、孔容量的增大，其吸附性能略有增大。朱维维等[12]研究的不溶于水的壳聚糖包埋魔芋组合物在相同条件下达到吸附平衡，对胆固醇吸附容量为114.8 mg/g，与SDa-KGM（90-2.4%-1）对胆固醇吸附容量相接近，但SDa-KGM制备工艺条件及原料更为简单。

图6 SDa-KGM胆固醇动力学吸附曲线

SDa-KGM（90-2.4%-1）数据中，利用t/Q对t作图线性关系良好，t/q=0.38903+0.00670t，相关系数R=0.9400，较吻合Lagergren准二级动力学模型，说明SDa-KGM吸附胆固醇不仅与溶液浓度有关，还受到化学吸附机理的控制，与脱乙酰化程度也有一定关系。SDa-KGM颗粒溶胀体积大则与胆固醇的接触面积大，有能力吸附更多的胆固醇。表面脱乙酰化魔芋葡甘聚糖颗粒表面的乙酰基脱除后成为羟基，而羟基是一个亲水基团，会减少与胆固醇的结合。

3 结论

通过简单的生产工艺解决KGM服用困难的难题。表面脱乙酰化KGM颗粒由于分子之间形成氢键而产生部分结晶作用，以结晶为节点形成颗粒表面的网状结构而成为不溶于水的颗粒。室温下KGM表面脱乙酰化试验表明，影响SDa-KGM颗粒的溶胀体积因素为乙醇的体积分数、氢氧化钠与KGM的质量比、反应时间。从红外分析可知，SDa-KGM依然保持了魔芋葡甘聚糖的一级主链结构。纤维素水解试验表明SDa-KGM还是保持了KGM原有的生物降解性。SDa-KGM在不同反应条件下的结构特征及水溶胀体积不同，对于减肥人群可以选择相对在水中溶胀体积大的SDa-KGM颗粒摄入来达到饱腹感以减少食物摄入的目的。

SDa-KGM模拟体外试验吸附三高代表物胆固醇，探究SDa-KGM对于消化道吸收的影响。SDa-KGM（90-2.4%-1）孔隙率为57.13%，孔容量达6.777 mL/g，骨架密度为0.190 g/mL，对胆固醇的吸附容量达103.5189 mg/g。SDa-KGM产品在控制“三高”方面很有前景，SDa-KGM通过改变反应条件可以改变颗粒的结构特征。随着孔容量增加，SDa-KGM吸附胆固醇等能力也会有所增强。

表面脱乙酰化魔芋葡甘聚糖在模拟试验中解决KGM服用困难的不足，表现出生物降解性、安全性及控制血脂等特性，在体重控制、“三高”控制、孕妇和儿童便秘等方面具有优势，为后续开发健康安全的降血脂药物或健康食品提供思路及依据。