植物半胱氨酸蛋白酶在植物生长发育中的功能研究

莫黎杰 刘夏瞳 李慧，2 陆海，2

（1. 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；2. 北京林业大学林木育种国家工程实验室，北京 100083）

植物蛋白酶广泛参与蛋白质的成熟、重建和降解，在植物生长发育过程中发挥着重要作用，调节着细胞增殖、分化、衰老和程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）等多个生物学过程［1-2］。蛋白酶功能异常会导致植物正常的生长发育进程受到影响。

蛋白酶通过水解肽键将底物裂解为小分子肽段。根据其催化位点分为4大类：半胱氨酸蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶［3］。MEROPS蛋白酶数据库（http：//merops.sanger.ac.uk）中根据进化关系将蛋白酶分为253个家族和61个亚家族［4］。拟南芥植物基因组编码约500-800蛋白酶，分布在60多个家族，30个不同亚家族中［2］，其中半胱氨酸蛋白酶约有140种，可以将其分为5个家族的15个亚家族［5］，本文将重点对半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白酶进行综述。植物半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CPs）分为木瓜蛋白酶家族（C1）、液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）、天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶家族（C14）、钙依赖半胱氨酸蛋白酶家族（C2）和其他半胱氨酸蛋白酶家族［3］。木瓜蛋白酶C1家族可分为C1A和C1B亚家族［6］，其中C1A半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶中数量最多的蛋白之一［7］。C1A亚家族的催化位点由高度保守的催化三联体组成：Cys 25，His 159和Asn 175，此结构域是区分该亚家族的重要分类标志［8］。根据功能和结构特征，可进一步将C1A半胱氨酸蛋白酶分为9个亚类，分别是：RD21Alike、RD19A-like、CEP1-like、XCP2-like、XBCP3-like、THI1-like、SAG12-like、AALP-like及CTB3-like［9］。

已有研究报道，植物半胱氨酸蛋白酶在调控植物生长发育中发挥着重要的功能。它们参与种子的贮藏蛋白的降解，根、茎、叶和花等器官的衰老和程序性死亡过程，对目前已经研究的参与植物生长发育过程的主要半胱氨酸蛋白酶及物种进行统计 （表1）。本文对植物半胱氨酸蛋白酶在植物各组织生长发育中的功能研究及其进展进行综述并展望，旨为进一步研究半胱氨酸蛋白酶的功能提供参考。

表1 半胱氨酸蛋白酶参与植物生长发育过程Table 1 Cysteine proteases involved in plant growth and development processes

1 叶衰老过程

叶片衰老是植物自然的生理过程，在叶片衰老过程中，叶肉细胞中的蛋白质被降解，半胱氨酸蛋白酶介导的蛋白质降解在该过程中发挥重要作用。叶片中蛋白质降解后，产生的营养物质（如氨基酸）被重新转移到生长或储存组织等部位，从而维持植物进一步的生长发育［10］。研究报道，通过对拟南芥［11］和大麦［12］叶片衰老过程中进行分析发现半胱氨酸蛋白酶的表达和酶活性在叶片衰老过程中会显著增加。Bhalerao 等［13］对田间衰老的白杨叶片和温室中幼嫩的叶片分别构建cDNA文库，并对其基因表达模式进行分析发现，老叶中半胱氨酸蛋白酶的表达序列标签（expressed sequence tag，EST）丰富，且相关基因上调。

在多个植物中，半胱氨酸蛋白酶特别是木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶C1A，参与叶片衰老过程中蛋白的降解［14］。例如，SAG12［15］、RD21A［16］、AtRD19A、RD19C、ALP / SAG2 / AALP / ALEU［17］、CTB1和CTB3等［18］。除拟南芥以外，其他植物种中发现与拟南芥AtSAG12同源的蛋白，编码这些蛋白的基因在叶衰老过程中上调或在叶片衰老过程中被诱导，参与调控叶片的衰老过程［14，18］。例 如，油 菜（Brassica napus）BnSAG12（BnSAG12-1和BnSAG12-2）［19］、烟草NtCP1［20］和NtSAG12［21］、水稻OsSAG39［22］、橡胶树HbSAG12H1［23］及辣椒CaCP［24］。

1.1 SAG12（senescence-associated gene 12）参与调控叶片衰老过程

半胱氨酸蛋白酶SAG12的表达模式与叶片衰老过程严格相关，Lohman等［15］在拟南芥中发现半胱氨酸蛋白酶SAG12蛋白酶在叶片衰老过程被诱导。SAG12启动子上游-603和-571 bp处含有一段高度保守的区域［25］，负责衰老特异调节，被作为拟南芥叶片衰老标记基因使用［26-28］。Otegui等［29］对ProSAG12：GUS转基因拟南芥分析发现衰老叶片中的SAG12仅含SAV的叶肉和保卫细胞中表达，将SAG12与GFP融合表达，发现SAG12定位于衰老叶片叶肉细胞和保卫细胞中具有强烈蛋白水解活性的衰老相关的囊泡中（senescence associated vacuoles，SAVs）。虽然与野生型相比，拟南芥sag12纯合突变体并无明显的叶衰老表型［29］。但是，James等［30］发现sag12纯合突变体中SAG12酶活性降低能够诱导其他天冬氨酸蛋白酶CND41-like活性增加，来弥补SAG12活性的缺失，共同参与叶片衰老过程中的Rubisco降解。同样，在油菜叶片衰老过程中，半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等多种蛋白酶被激活，参与Rubisco蛋白降解和氮素转移［31］。James 等［30，32］研究发现，SAG12在叶片衰老过程中的氮素转移发挥重要作用。在低氮条件下，SAG12不仅能将叶片衰老过程中释放的氮素转移到种子中，还能将根中蛋白质降解释放出的氮素转移到种子中，为其提供氮素，从而确保种子产量。

水稻中存在与AtSAG12同源的蛋白，即Os-SAG12-1［33］和OsSAG12-2［34］。Singh等［34］对OsSAG12-2的生化功能进行研究，大肠杆菌中重组OsSAG12-2能够自我水解成有功能的蛋白酶，该酶具有蛋白水解酶功能，能水解偶氮酪蛋白底物。OsSAG12-1与AtSAG12相似度最高，在衰老和病原体感染过程中，OsSAG12-1的表达被诱导，RNAi转基因水稻株系中该基因表达下调，诱导细胞死亡［33］；在盐和紫外线胁迫诱导条件下，OsSAG12-2在RNAi转基因植株中表达下调会增强胁迫诱导的细胞死亡，过量表达OsSAG12-1 和OsSAG12-2可减缓死亡过程［33］。说明OsSAG12-1和OsSAG12-2都是胁迫诱导细胞死亡的负调节因子［34］。

1.2 HvPap-14参与叶绿体蛋白的降解来介导叶片衰老过程

作为单子叶植物，大麦被用于研究单子叶植物中叶片衰老的模式植物。大麦的C1A家族由41个成员组成（HvPap-1至HvPap-42），在黑暗诱导条件下，对大麦叶片衰老过程中C1A家族成员的蛋白酶基因表达模式分析发现，HvPap-4、HvPap-7、HvPap-8、HvPap-13、HvPap-14、HvPap-15和 HvPap-22在衰老叶片中表达上调［18］。Díaz-Mendoza等［18］对黑暗诱导衰老叶片中的大麦半胱氨酸蛋白酶进行研究发现，HvPap-1和HvPap-19定位于衰老叶片叶肉细胞的小囊泡（可能是SAV），它们参与叶绿体蛋白降解的过程。HvPap-1在黑暗和氮缺乏的条件下被诱导［12］。在自然衰老和黑暗诱导衰老过程中，过表达HvPap-1加速了叶片的衰老，而HvPap-1沉默则延迟了叶片衰老过程［12］，说明HvPap-1参与调控叶片衰老过程。在干旱胁迫条件下，HvPap-1和HvPap-19表达上调，HvPap-1和HvPap-19的敲除可减少干旱胁迫条件下叶片蛋白质的降解［35］。HvPap-14基因在衰老的叶片中表达量最高［36］。Frank等［37］免疫电镜分析发现其酶原存在于类囊体膜和类囊体腔中，而HvPap-14的成熟酶定位于叶绿体类囊体膜上；体外激活实验证实HvPap-14酶原在pH<6条件下被激活为成熟酶；酶活分析发现HvPap-14的底物是LHCB（叶绿素a/b结合蛋白），PSBO（光系统II的外周蛋白）和叶绿体蛋白Rubisco大亚基，说明在叶片衰老过程中，大麦HvPap-14大量表达并被激活，通过参与叶绿体类囊体膜蛋白和Rubisco大亚基的降解，来介导叶片衰老的过程［12］。

总之，半胱氨酸蛋白酶通过催化叶绿体中Rubisco蛋白的降解，实现氮素的转移，是叶片衰老过程中蛋白质降解的重要途径。除了SAG12，越来越多的半胱氨酸蛋白酶被发现参与该过程，它们之间存在功能相似性，在不同衰老条件下，其酶学机制及蛋白质降解底物和降解途径是否也存在相似性，有待进一步研究。

2 维管组织的PCD过程

植物维管组织中木质部细胞中导管分子和纤维细胞发生程序性细胞死亡（PCD）过程，其液泡破裂，并释放出半胱氨酸蛋白酶和其他水解酶，内容物降解并形成空腔，同时次生壁发生增厚，从而使导管分子（tracheary element，TE）具有输水功能［38-39］。

2.1 ZCP4参与导管分子PCD过程

半胱氨酸蛋白酶在导管分子PCD过程中被诱导。体外培养百日草悬浮细胞可诱导形成导管分子，被广泛用于研究导管分子分化的模式系统。百日草ZCP4编码木瓜蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶，在TE早期分化过程的PCD中起作用［40-41］。ZCP4基因在TE分化早期［42-43］表达，在拟南芥中表达proZCP4∶GUS，观察其在木质部导管分子分化过程中的表达模式发现，ZCP4在子叶、胚轴和根中早期分化的导管分子（TE）中特异表达，而且仅在未成熟的导管分子中表达，而不在成熟导管分子和其他细胞中表达，说明可作为导管分子早期分化的标记基因［44］。对ZCP4启动子进行分析发现，11 bp的导管分子顺式作用元件TERE（tracheary-elementregulating cis-element）序 列（CTTNAAAGCNA）是TE特异表达所必须的，它决定了该基因在TE特异性表达模式。除ZCP4以外，TERE顺式作用元件也存在于TE分化过程中与PCD相关的蛋白酶基因和与次生壁形成相关基因的启动子中，说明TERE顺式作用元件也决定了这些基因在TE中的表达特 异性［45］。

2.2 AtXCP1（xylem cysteine protease 1）和AtXCP2参与木质部导管分子PCD过程

拟南芥半胱氨酸蛋白酶AtXCP1和AtXCP2为同源蛋白，二者在木质部中特异性表达，并在木质部导管分子（tracheary elements，TEs）PCD中发挥作用［46］。XCP1和XCP2编码约40 kD的前体蛋白，在酸性条件下中，去除N端信号肽和和前体结构域，XCP1和XCP2被激活，形成具有活性的成熟蛋白酶。利用XCP1和XCP2启动GUS融合蛋白表达，研究其在拟南芥中的表达模式，发现二者均在分化的TE中表达［46］。XCP1和XCP2在根的TE自溶过程中发挥作用［47］。Avci等［47］将根中TE的自溶过程分为两个步骤，第一步是微自溶（micro-autolysis）即中央大液泡完整时发生的自溶；第二步，大规模自溶（mega-antolysis）即中央大液泡破裂后引起的自溶。通过对xcp1、xcp2单突变体和 xcp1 xcp2双突变体根中TE的自溶过程进行电镜分析发现，XCP1和XCP2主要参与中央液泡破裂前的微自溶过程，同时也与其他水解酶一起，参与了液泡膜破裂后细胞内容物清除的过程。在xcp1单突变体和xcp1 xcp2双突变体中，由于XCP1表达缺失，TE空腔中出现内容物未完全降解的现象，而且xcp1 xcp2双突变体中未降解的内容物比xcp1更致密，而xcp2突变体的表型与野生型差不多，说明在微自溶过程中XCP1发挥的作用要大于XCP2的作用［47］。

2.3 γVPE参与木质部纤维细胞的PCD过程

液泡加工酶（VPE）属于一类新的半胱氨酸蛋白酶，在植物中调节液泡蛋白的成熟和活化，通过液泡降解来介导植物细胞的程序性细胞死亡过程（PCD）。在拟南芥中有αVPE、βVPE、γVPE和δVPE四个蛋白酶，根据其表达部位，可以分为营养性VPE和种子型VPE，其中αVPE和γVPE在营养器官表达，βVPE和δVPE在种子中表达［48］。研究表明，γVPE在营养组织中表达，且在茎的形成层，初级韧皮部和初级木质部中特异性表达［49-50］。γVPE在木质部细胞的PCD过程中发挥重要作用。在与野生型拟南芥相比，γvpe突变体中木纤维细胞内容物降解延迟和细胞次生壁增厚。体外实验表明，γVPE在pH 值为7.0时以酶原形式存在，在pH 值为5.5条件下可通过自催化转化为40 kD成熟酶。半胱氨酸蛋白酶CEP1也与木质部发育过程中PCD和次生壁增厚有关［51］，与γVPE存在上下游酶原激活关系，共同调控木质部细胞的PCD过程。体外实验表明，γVPE能在体外催化CEP1酶原，使其转化成成熟蛋白。在γvpe拟南芥突变体的茎发育过程中，利用Western能检测大量CEP1酶原，但缺少CEP1成熟酶，说明γVPE的缺失导致CEP1蛋白酶的成熟受到抑制。表明γVPE通过激活CEP1酶原的成熟来调控茎木质部细胞的发育，参与茎发育过程中木质部纤维细胞的PCD过程［52］。

半胱氨酸蛋白酶是调控维管组织PCD过程的关键酶类，参与该过程的蛋白酶存在普遍的冗余现象，多个酶拥有相似或相近的功能，却隶属于不同的半胱氨酸蛋白酶家族，它们如何协调发挥作用有待进一步研究。

3 种子萌发过程

随着谷物种子的发育和成熟，贮藏蛋白聚集于胚乳中；当谷物种子萌发时，蛋白酶从盾片上皮细胞和糊粉层释放到胚乳中，降解胚乳中的贮藏蛋白，产生的氨基酸和小肽被盾片吸收，然后运输到正在生长的幼苗中，为幼苗的生长和发育提供所需的氨基酸［53-54］。半胱氨酸蛋白酶的正常启动是保证种子正常萌发和幼苗正常生长发育的关键［55］，因此必须严格控制蛋白酶活性启动时间节点，以避免蛋白质在非萌发期被降解而影响种子萌发。

醇溶蛋白是谷物种子中的主要储存蛋白，在玉米和小麦种子种子萌发过程中，半胱氨酸蛋白酶能够降解约90%醇溶蛋白。在大麦中，42种蛋白酶参与其种子萌发，其中27种是半胱氨酸蛋白酶［56］。木瓜蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶（C1A）和液泡加工酶（VPE）是参与双子叶植物和单子叶植物种子萌发的主要蛋白酶［3，55，57］，负责降解种子存储蛋白，为幼苗的生长提供营养。不同物种中多个半胱氨酸蛋白酶均参与种子萌发过程中的蛋白质降解过程，如单子叶植物大麦EPA［58］、EPB［53-54］、HvPap-19和HvPap-20［59］、aleurain［60］、HvPap-1［61-62］、HvPap-4和HvPap-6［63］、WEB-1［64］、水稻OsVPE-1［65］和REP-1［66］；双子叶植物拟南芥AP2，PAP3和RD19A［9］；紫云英pSK19［67］，黑吉豆SH-EP［68］和菜豆PvCEP-1［69］等。

3.1 半胱氨酸蛋白酶B（endoprotease B，EPB）参与储存蛋白的降解

体外实验证实，半胱氨酸蛋白酶EPA和EPB均可降解醇溶蛋白。在黑小麦中发现的EP8是EPA的同源蛋白，在种子萌发过程中在糊粉层中合成，负责在种子发芽过程中动员存储的蛋白质，其活性可被内源性胱抑素TrcC-4抑制［54］。Koehler 等［70］从大麦中分离和鉴定出半胱氨酸蛋白酶B（EPB1和EPB2）。Mikkonen等［53］通过原位杂交发现EPB在种子发芽后24 h在上皮细胞中表达，然后定位于胚乳周围的糊粉组织表达。种子萌发过程中，胚中赤霉素含量增加并转移到糊粉层，诱导相关蛋白酶基因的表达。赤霉素能够诱导EPB基因的表达，EPB-1启动子中含有赤霉素顺式作用GARE元件RTAACARANTCYGG，嘧啶盒（YCTTTTY）和Box I（TATCCAT）是GA诱导所必需的［71］。

3.2 βVPE介导种子储存蛋白的成熟和δVPE参与种皮发育过程

βVPE和δVPE属于种子型VPE，βVPE在种子发育晚期储存蛋白形成时期表达，介导种子储存蛋白的成熟过程，而且是储存蛋白加工成熟过程所必需的，在βvpe突变体种子中，90%VPE活性丧失［48］。当βVPE缺失后，αVPE、γVPE和天冬氨酸蛋白酶起到部分弥补βVPE的作用［72］。在种子中，种皮紧紧包裹胚和胚乳，在休眠阶段保护胚免受机械损伤、病虫害侵袭及紫外线破坏，种皮还能为胚胎发育转移母体营养的桥梁作用。在种子发育早期，种皮ii2和ii3两层细胞会经历PCD过程。而δVPE仅在种子发育早期的种皮ii2和ii3两层细胞中表达，参与种皮发育过程中特定细胞层的细胞死亡过程。免疫电镜结果显示，δVPE定位于PCD过程中的ii2和ii3细胞内外细胞壁上。当δVPE缺失突变，这两层细胞的PCD延迟［73］。

3.3 HvPap-1参与种子萌发过程中蛋白质动员

对半胱氨酸蛋白酶41个成员在大麦种子萌发过程中的表达模式进行分析发现［18］，HvPap-4，Hv-Pap-6和HvPap-10在发芽的种子中高水平表达而且具有种子特异性表达模式［63］。HvPap-1由GA诱导，定位于胚中的蛋白体和囊泡，负责胚乳中的蛋白质降解，参与大麦种子萌发过程中蛋白质动员作用［61］。过量表达HvPap-1减少了种子中的淀粉量并提高了发芽率，而抑制HvPap-1表达则增加种子中的淀粉量且降低发芽率［62］。大麦中HvPap-1，HvPap-6和HvPap-19 定位于胚中，但HvPap-1，HvPap-6和HvPap-19 蛋白酶积累存在差异，可能不同的C1A半胱氨酸蛋白酶具有特异降解存储蛋白的能力。

总之，半胱氨酸蛋白酶参与降解或动员种子中存储蛋白，在种子发芽和幼苗生长中起重要作用，半胱氨酸蛋白酶的表达和活性受GA，ABA和胱抑素等的调节。

4 根的发育过程

研究表明，拟南芥中3种含KDEL基序的半胱氨酸蛋白酶［74-77］，即AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3，以及毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5［78］在根的发育过程中起作用。

4.1 AtCEP2参与初生根的生长过程

AtCEP2参与了初生根的生长并影响根的发育过程［77］。AtCEP1和AtCEP2均在根的表皮层根尖细胞和侧根尖的顶端（PCD位点）以及在侧根生长期表达［74-75］。AtCEP2定位于根冠表皮细胞壁，无活性的AtCEP2酶原被运输或扩散到细胞壁，在pH值低于6.5时通过自催化转化为成熟酶［74，79］。从即将发生PCD的根冠细胞释放出的有活性AtCEP2可能扩散到邻近的质外体和细胞壁，参与蛋白质降解，进而影响表皮细胞伸长。AtCEP2的缺失，导致LR原基延迟出现。说明AtCEP2是根细胞生长所必需的，这可能影响了细胞壁的重塑能力［77］。

4.2 PtCP5参与主根生长过程

研究发现，毛果杨半胱氨酸蛋白酶PtCP5影响根的发育过程，如张强［78］克隆获得了毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5，通过生物信息学分析发现，PtCP5属于木瓜类半胱氨酸蛋白酶家族中B类组织蛋白酶。利用实时定量PCR技术对PtCP5进行了组织表达定位分析，PtCP5主要在根部和叶部表达。构建了半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5的正义植物表达载体，并通过花序侵染法对野生型拟南芥进行侵染，成功获得PtCP5正义转基因拟南芥株系。通过对PtCP5正义转基因的拟南芥进行了主根长度分析，结果显示，与野生型相比，PtCP5正义转基因拟南芥主根长度明显长于野生型。说明PtCP5参与主根生长影响根的发育过程。

目前检测到AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3以及 PtCP5等半胱氨酸蛋白酶在根中表达量较高，且对根的生长发育有一定的影响，但是这些酶如何调节根的发育机制仍需进一步研究。

5 花药绒毡层PCD过程

花药是花粉的发育场所，为花粉的发育提供营养物质。绒毡层是花药囊最内层细胞，在花药发育后期会经历PCD，绒毡层细胞降解不正常会导致花粉败育。半胱氨酸蛋白酶在绒毡层的PCD过程中起着重要作用［80-81］。在多种植物中发现木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶参与了绒毡层的PCD过程。例如，烟草中的NtCP56［80］；拟南芥半胱氨酸蛋白酶51（CP51）和AtCP56［82］、CEP1［83］、βVPE［84］；甘 蓝型油菜BnaC.CP20.1［85］；水稻OsCP1［86］，这些蛋白酶基因的异常表达影响了绒毡层PCD进程，导致了不同程度的花粉败育。

5.1 CEP1参与绒毡层PCD过程

半胱氨酸蛋白酶CEP1在拟南芥绒毡层细胞的程序化死亡和花粉发育的过程中起重要作用［83］。CEP1的表达量与花粉的可育程度相关，CEP1的表达量过高或者过低，都会造成花粉不同程度的败育。根据形态变化可将拟南芥花药的发育分为14个时期，绒毡层在第5时期开始形成，同时小孢子母细胞分化，随后通过减数分裂形成四分体；到第9-10时期绒毡层细胞开始降解，单倍体小孢子从四分体中释放，然后进行不对称的有丝分裂形成双核小孢子；到第11-12时期绒毡层细胞急剧降解完成，此时双核小孢子中的生殖细胞核经历一次有丝分裂形成三核花粉［87］。CEP1通过参与绒毡层降解，从而影响花粉发育。免疫组化显示拟南芥半胱氨酸蛋白酶CEP1基因特异地的在花药发育的第5-11时期的绒毡层中表达。免疫电镜和western共同证实，CEP1花粉发育早期第5阶段，无活性的CEP1酶原储存于液泡中，在绒毡层细胞的PCD起始之前第6-8时期，在酸性的环境下，CEP1前体酶自催化去除信号肽和前肽，部分酶原转化成有活性的成熟酶。在绒毡层细胞PCD过程中第9-11时期CEP1成熟酶从破裂的液泡中释放，参与细胞质内物质的降解。在cep1突变体中，绒毡层细胞壁的降解，绒毡层分泌结构的形成和细胞核的降解被抑制，不能给花粉发育提供足够的营养和组分，导致花粉外壁发育不正常，大部分花粉败育。研究发现，CEP1酶原一方面可自催化转变为成熟形式［83］；另一方面，CEP1酶原成熟还需要βVPE的参与［84］。

5.2 βVPE激活其他蛋白酶共同参与绒毡层PCD 过程

Cheng等［84］利用Proβvpe：GUS检测βVPE的表达模式，发现βVPE在拟南芥花药发育的5-8时期高水平的表达，且在绒毡层中特异性表达。体外激活实验显示51 kD的βVPE酶原在pH5.2条件下可自催化转化为27 kD成熟形式，免疫杂交显示在花药发育的βVPE在5-6时期以原酶和少量成熟酶的形式存在，在7-8时期完全转化为成熟酶形式。说明花药发育过程中βVPE在酸性条件下自催化形成有活性的成熟蛋白。在花发育过程中，βVPE酶原激活时间早于CEP1，同时βvpe与cep1突变体的花药表型类似，表现出液泡裂解的延迟和花粉育性的降低。免疫杂交实验证明，在βvpe突变体中花药发育过程中，CEP1和RD19A的成熟受到严重抑制，RD19C完全不能被催化成成熟酶不能完全转化为成熟酶［84］。说明βVPE作为一个早期被激活的半胱氨酸蛋白酶，处于蛋白酶激活网络的上游，催化绒毡层发育过程中CEP1和其他半胱氨酸蛋白酶的成熟，从而参与绒毡层降解并且影响花粉发育［84］。

总之，花药绒毡层PCD对于花粉发育至关重要，目前一些与花药绒毡层PCD发育相关的半胱氨酸蛋白酶被报道，这些半胱氨酸蛋白酶在此过程中发挥直接或者间接作用，但是这些半胱氨酸蛋白酶在PCD过程中如何被激活；不同蛋白酶之间否存在上下游激活关系；它们之间的酶学调控网络需要进行深入研究。

6 总结与展望

半胱氨酸蛋白酶在植物生长发育过程中发挥重要作用，不仅参与种子萌发，根生长及叶片衰老过程，还参与茎中导管分子及花药中绒毡层细胞的细胞程序性死亡过程。半胱氨酸蛋白酶在这些组织中发挥蛋白质的降解作用，为新细胞的生长提供营养和组分，保证植物生长发育顺利进行。有些半胱氨酸蛋白酶如δVPE在特定组织表达，影响特定组织的蛋白质降解及生长发育过程。但是越来越多的研究发现，某些半胱氨酸在多个组织中表达，影响多个组织的发育进程，而且半胱氨酸蛋白酶在不同组织功能不一样，如SAG12除了参与叶片衰老，还与根发育相关［88］。βVPE除了参与种子中储存蛋白的合成［48］，还与花药发育中绒毡层的细胞PCD有关［84］。CEP1不仅参与花药绒毡层PCD过程，也参与茎中导管分子和纤维细胞的PCD过程，其他半胱氨酸蛋白酶是否在不同的植物组织中参与不同的功能，或者同一蛋白酶在不同组织中是否发挥着类似功能，还需要进一步深入研究。

绝大多数的半胱氨酸蛋白酶以酶原形式存在，并且在特定的时间和地点被激活而发挥作用。体外实验表明，不同的半胱氨酸蛋白酶激活条件不同，pH值是蛋白酶激活的重要条件，有些蛋白能够在特定pH值条件下发生自激活，而有些蛋白酶的激活需要其他蛋白酶的参与，半胱氨酸蛋白酶在植物发育过程中如何被激活以及蛋白酶与蛋白酶之间的激活调控网络也值得进一步研究。