转基因番木瓜基因组DNA的快速制备和PCR 检测方法

2021-08-11潘志文陈伟庭高洁儿周峰姚涓王声斌姜大刚

生物技术通报 2021年6期

潘志文陈伟庭高洁儿周峰姚涓王声斌姜大刚

（农业农村部植物及植物用微生物生态环境安全监督检验测试中心（广州）/华南农业大学生命科学学院，广州 510642）

自1996年转基因作物商业化以来，创造了巨大的经济效益和生态效益，为全球的粮食安全、气候变化和环境可持续发展做出了巨大贡献。全球转基因作物种植规模日益扩大，根据国际农业生物技术应用服务组织（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）发布的报告，2018年全球转基因作物种植面积接近2亿 hm2，主要包括玉米、大豆、棉花等［1］。在我国，商业化种植的转基因作物主要包括转基因棉花和转基因番木瓜。

番木瓜（Carica papaya L.）又名木瓜，是著名的“岭南佳果”。番木瓜生育期内易受病害侵染，番木瓜环斑病毒（papaya ring spot virus，PRSV）的肆虐，导致全球各地的番木瓜品质和产量大幅度降低，严重影响相关产业的发展。1991年，Fitch等［2］将PRSV病毒编码外壳蛋白（coat protein，CP）的基因片段转入番木瓜，培育出抗环斑病毒病的转基因番木瓜55-1等品系，并于1998年5月在夏威夷商业化生产。由我国自主研发的转基因番木瓜“华农1号”品系［3］，也于2006年获得安全证书并准许商业化生产。Cheng等［4］研发的转基因番木瓜GM YK品系也在田间表现出优良的抗性。鉴于转基因番木瓜已经在我国批准商业化生产，并且具有较大的市场份额，为保护消费者的知情权和选择权，加强对转基因番木瓜的监管，建立和优化快速、准确的检测方法非常必要。

在转基因作物的检测方法中，基于PCR的核酸检测方法被广泛应用。合适的DNA提取与纯化方法在很大程度上决定了PCR检测的准确性与可靠性［5］。DNA的提取过程中要减少各种因素对核酸的破坏与降解作用，尽量去除材料中的蛋白质、多糖以及提取过程中使用的有机溶剂等杂质［6］。因而，DNA提取质量直接影响后续PCR检测的质量和效率。常用的提取DNA的方法有十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基硫酸钠（SDS）法、高盐低pH法、聚乙烯吡咯烷酮法、试剂盒法等，但这些方法都需要多步操作，耗时繁琐［6］。因此，快速、简易抽提DNA的方法一直是研究的热点，其中以水稻为材料的报道较多［7-10］；Zou等［11］研究建立的方法可以在30 s内从植物、动物或微生物材料中提取得到质量较高的核酸用于PCR检测，但该方法需要在抽提过程中用滤纸将DNA转移，对技术的要求较高。基于以上，本研究建立番木瓜材料基因组DNA的简易快速制备的方法，大大提升转基因番木瓜检测的效率，为转基因番木瓜检测提供重要的技术储备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料本研究所用的非转基因番木瓜台农2号、转基因番木瓜华农1号材料均为本实验室保存。

1.1.2 试剂本研究所用制备缓冲液（10 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mol/L KCl，pH9.5）为国产分析纯试剂和重蒸馏水配置；PCR试剂TaKaRa Taq Hot Start Version与TaKaRa Premix Ex Taq（Probe qPCR）、6×上样缓冲液，购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 仪器本研究所用主要仪器如下：Tissue Lyser高通量组织研磨仪（QIAGEN，德国）；台式高速冷冻离心机Centrifuge 5415R（Eppendorf，德国）；T100TMThermal Cycler PCR热循环仪与CFX Connect Real-Time System实时荧光PCR系统，普通电泳系统PowerPac Basic与SUB-CELL Model 96，凝胶成像系统Gel DocXR+（BIO-RAD，美国）。

1.2 方法

1.2.1 实验材料DNA的制备根据不同番木瓜材料，DNA制备方法略有不同。

叶片材料：使用3-5 mm孔径的圆形打孔器在叶片上打孔，把切割下来的圆形叶片置于2.0 mL离心管中，加入3颗3-5 mm硬质合金钢珠，使用高通量组织研磨仪匀浆。12 000 r/min离心30 s，1片圆形叶片（约25 mg）加入100 μL制备缓冲溶液，涡旋混匀，65℃加热10 min，12 000 r/min室温离心10 min。

果肉：称取100-200 mg果肉置于2.0 mL离心管中，加入3颗3-5 mm硬质合金钢珠，使用高通量组织研磨仪匀浆。12 000 r/min离心30 s，每100 mg材料加入200 μL的制备缓冲溶液，涡旋混匀，室温静置10 min，12 000 r/min室温离心10 min。

吸取经过离心后的上清液20 μL，加入制备缓冲溶液进行10倍稀释即为DNA溶液的原液，通过加入制备缓冲溶液进行5-25倍稀释用于PCR检测。

1.2.2 引物与探针 Papain基因PCR方法引物探针参考国家标准农业农村部公告第323号-1-2020 《转基因植物及其产品成分检测番木瓜内标准基因定性PCR方法》［12］、NPT II基因PCR方法引物探针参考中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1196-2012 《转基因成分检测玉米检测方法》［13］、CaMV 35S启动子、NOS终止子PCR方法引物探针参考国家标准农业部1782号公告-3-2012 《转基因植物及其产品成分检测调控元件CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV 35S终止子定性PCR方法》［14］。所有引物及探针序列信息如表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 转基因木瓜筛选检测实时荧光PCR所用引物及探针序列信息Table 1 Primers and probes sequence information used in transgenic papaya real-time PCR detection

1.2.3 PCR方法本研究使用的PCR方法包括普通PCR方法和实时荧光PCR方法。

普通PCR扩增体系包含：25 ng/μL DNA模板2.0 μL，5 U/μL Taq HS DNA聚合酶0.125 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）2.5 μL，重蒸馏水补至25 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35次循环；72℃延伸5 min。PCR扩增完成后，在每个PCR反应管内加入6×上样缓冲液5.0 μL，混合均匀后取10.0 μL于2%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束进行凝胶成像分析。

实时荧光PCR扩增体系包含：2×TaKaRa Premix Ex Taq（Probe qPCR）10 μL，DNA模板2.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，10 μmol/L探针0.4 μL，重蒸馏水补至20 μL。PCR扩增程序为：第一阶段95℃ 1 min；第二阶段95℃ 5 s；60℃ 30 s，循环数45（在第二阶段的60℃延伸后采集荧光信号）。

2 结果

2.1 基因组DNA的制备

本研究制备番木瓜基因组DNA关键步骤主要包括根据匀浆样品的量，加入适量的制备缓冲液；对缓冲液上清进行适当倍数稀释。用于制备DNA的番木瓜组织制备流程如图1所示，叶片的制备主要使用小孔径打孔器，大约3-5 mm直径；番木瓜果肉的制备主要采用称量的方法。

图1 叶片、果肉基因组DNA溶液制备流程图Fig. 1 Genomic DNA preparation process of leaf and fruit

本方法制备番木瓜基因组DNA溶液由于含有较多的杂质，不能采用常用的方法对其进行浓度测定，我们对其质量的评价主要以PCR方法进行。

2.2 基因组DNA的普通PCR检测

为了测试简易法制备的基因组的质量，通过普通PCR的方法对其进行检测。对鲜叶片、干叶片以及果肉基因组DNA溶液，分别以原液、5倍、25倍和125倍稀释液共4个梯度浓度进行番木瓜内标准基因Papain的普通PCR扩增。电泳结果显示，番木瓜鲜叶片基因组DNA溶液经过5-125倍稀释以后均能扩增得到清晰特异的目的条带，其中125倍稀释的DNA溶液扩增条带较弱，原液扩增条带与5倍稀释DNA条带亮度没有明显变化（图2-A）；番木瓜干叶片基因组DNA溶液经过稀释以后，原液扩增条带最亮，5倍稀释样品次之，25倍稀释更弱，125倍稀释的DNA溶液扩增条带最弱，只能隐约看到条带（图2-B）；番木瓜果肉基因组DNA溶液PCR结果显示，只有DNA原液和经过低倍稀释（5倍）扩增的条带清晰、特异（图2-C）。说明，本方法建立的快速DNA制备方法获得的番木瓜基因组DNA，可以应用于PCR检测，并且抽提效果新鲜叶片强于干叶片，强于番木瓜果肉。

图2 内标准基因Papain普通PCR扩增Fig. 2 PCR amplification of endogenous gene Papain

2.3 基因组DNA的实时荧光PCR检测

为了验证本研究中的制备缓冲液对实时荧光PCR没有抑制作用，首先用制备缓冲液稀释CTAB法提取的番木瓜基因组DNA，设置共7个梯度浓度作为梯度标准品（Std1-Std7）进行实时荧光定量PCR扩增，结果（表2）显示，Std1-Std7标准品的重复性良好，标准曲线扩增效率为90.73%，相关系数R2=0.998 7（图3-A），符合定量检测要求，表明制备缓冲液可以直接用于实时荧光定量PCR检测中。

对使用本方法提取番木瓜鲜叶片、干叶片以及果肉基因组DNA，并以原液5倍、25倍和125倍稀释液共4个梯度浓度进行Papain基因实时荧光PCR扩增。鲜叶片和干叶片样品提取的DNA标准曲线扩增效率分别为95.83%和102.09%（表2），相关系数分别为R2=0.991 3（图3-B）和R2=0.999 4（图3-C），不同稀释倍数的样品重复性也较好。果肉样品提取的DNA，1-25倍稀释时重复性较好；但当稀释倍数为125倍时，部分样品出现扩增不稳定，重复性较差，部分平行没有出现扩增曲线，导致了所计算的标准曲线扩增效率达到145.32%（表2），相关系数R2=0.987 2（图3-D），说明果肉样品可能含有较多的杂质影响PCR扩增。因而，本方法提取的叶片DNA在25倍以下的稀释浓度，能满足实时荧光PCR检测的要求，而果肉样品的基因组DNA制备，高倍稀释时不能满足实时荧光PCR检测的要求。

表2 番木瓜Papain基因实时荧光定量PCRTable 2 Real-time fluorescence PCR of papaya endogenous Papain gene

图3 番木瓜Papain基因实时荧光PCR标准曲线Fig. 3 Real-time fluorescence PCR standard curve of Papain gene

2.4 快速制备DNA模板灵敏度验证

为了进一步对本研究建立基因组DNA制备方法进行验证，制备质量分数为0.1%、1%、5%转基因番木瓜的鲜叶片、干叶片、果肉样品，用本方法制备DNA溶液（原液）进行转基因成分验证。普通PCR电泳结果显示，Papain基因在所有的检测样品中都有特异的条带扩增，大小与预期一致（图4-A）；而CaMV 35S启动子（图4-B）、NOS终止子（图4-C）、NPTⅡ基因（图4-D）在0.1%的低浓度时，扩增条带较弱；在5%的浓度时，扩增条带强清晰特异，与预期结果相符。这些结果表明本方法制备的基因组DNA，在进行转基因番木瓜普通PCR方法检测时，可以获得良好的效果。

图4 转基因番木瓜普通PCR电泳结果Fig. 4 PCR electrophoresis results of transgenic papaya

荧光定量PCR的结果（表3）显示：在5%转基因番木瓜的鲜叶片、干叶片、果肉样品的检测中，内标准基因Papain、外源基因CaMV 35S启动子、NOS终止子、NPTⅡ基因均能得到典型扩增曲线和Ct值，且标准偏差值（SD）范围在0.010-0.150之间，重复性良好；在1%样品检测中，不管内标准基因还是外源基因，均能得到典型扩增曲线和Ct值，且SD值范围在0.010-0.504之间，重复性较好；在0.1%样品检测中，不管内标准基因还是外源基因，叶片样品均能得到典型扩增曲线和Ct值，Ct值均小于36，且SD值范围在0.036-0.551之间，重复性较好；而0.1%的果肉样品，虽然内标准基因还是外源基因均能得到典型扩增曲线和Ct值，但外源基因部分平行扩增Ct值大于36，重复性稍差，如CaMV 35S和NPTⅡ基因的Ct值就差异比较大，SD值分别为1.660和1.415。以上结果说明用本方法制备的基因组DNA，可以用于不同叶片的检测中，但是对于果肉等含有杂质比较多的样品的检测，在低含量时检测具有局限性。

表3 转基因番木瓜实时荧光定量PCR数据与分析Table 3 Data and analysis of real-time fluorescence PCR of transgenic papaya

3 讨论

目前，已有多个转基因番木瓜品系被各国批准商业化应用。在我国，由于转基因番木瓜“华农1号”已经批准商业化种植，对转基因番木瓜的管理和检测技术的研究收到越来越多的重视。目前对转基因番木瓜的检测主要使用基于核酸的检测方法，其中PCR方法是目前最成熟、应用最多的检测方法。本研究建立了快速简便的基因组DNA提取方法，与传统的核酸提取方法（如CTAB法、SDS法、试剂盒法等）相比具有巨大的优势［6］，本研究建立的快速抽提和PCR检测方法在特异性和灵敏度方面，可以满足叶片和果实等不同组织的检测需要。因此，在满足PCR检测要求的前提下，开发更简单高效的转基因番木瓜基因组DNA提取方法十分必要。

本方法的关键在于控制加入番木瓜材料的用量与加入制备缓冲液的比例，避免获得的PCR模板中含过多的杂质抑制PCR扩增。本方法制备基因组DNA步骤简单，仅需一次匀浆和离心，然后进行简单的稀释，即可直接获得基因组DNA溶液用于普通PCR扩增以及实时荧光PCR扩增，稀释范围从1-25倍均可，适用范围广，效果良好，能制备较多的DNA溶液，满足多次PCR检测的需要。本方法与传统的CTAB或SDS抽提方法相比，操作步骤大幅度减少，节省了抽提时间；即使与商业化的抽提试剂盒相比，也更简单。而且，从样品匀浆、制备PCR模板到PCR扩增均可使用96孔方孔板、96孔PCR板、多通道微量移液器等进行，更加高效，因而特别适合用于大批量番木瓜材料的转基因成分检测，能大大提高转基因番木瓜检测工作的效率。

本研究结果显示，本方法用于制备转基因番木瓜叶片和果肉样品基因组DNA溶液效果较好，使用普通PCR方法及实时荧光PCR方法进行转基因成分检测时，含量低至0.1%的转基因番木瓜基因组DNA仍然能扩增得到清晰的目的条带或典型扩增曲线和Ct值，表明本方法可以用于转基因番木瓜叶片与果肉样品检测。对于含杂质较多的果肉等样品梯度稀释时，实时荧光标准曲线的扩增效率超出正常范围，因此，还需要进一步调整优化提取方法和条件，以达到更好效果。