苦瓜桑叶复合颗粒对高脂饮食诱导肥胖大鼠脂糖代谢及肠粘膜屏障异常的改善作用

程晓晓，张邈馨，王 嫚，耿旭芳，胡京艺，王 振，高佳萌，王亚文，李 丽，赵 丁

（河北医科大学药学院，河北石家庄 050017）

肥胖（obesity）是体内脂肪积聚过多而致体重超常的一种慢性疾病[1]。随着人们饮食习惯及生活方式的改变，肥胖发病率呈逐年上升趋势[2]，并会引起糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化等多种代谢性疾病，危害人类健康[3]。目前已上市减肥药多存在导致恶心、呕吐、便秘、降低血糖等副作用，因此，开发安全性高、毒副作用低的减肥药物及保健产品是很有必要的。“药食同源”类中药是一类既可作药用又可食用的中药，兼顾安全、营养、保健和治疗的功能。因其安全性高，副作用小，在世界范围内广受欢迎，亦对减肥药物及保健产品开发具有重要意义。

苦瓜（bitter melon）是葫芦科苦瓜属植物苦瓜（Momordica charantia）的未成熟果实, 广泛种植于中国及东南亚国家，是一味传统的药食同源类中药。苦瓜含有苦瓜皂苷、苦瓜多糖、苦瓜蛋白、多肽和黄酮等多种生物活性成分，具有较高的营养、保健及药用价值，可降血糖、免疫调节、抗肿瘤及抗病毒等，对糖尿病、心脏病等均有一定治疗作用[4−6]。桑叶（mulberry leaf）是桑科植物桑树（Mori folium）的干燥叶，内含多种维生素、微量元素、氨基酸、黄酮及生物碱，亦具有降血糖、降血脂、减肥等功效[7−9]。研究证明，苦瓜、桑叶合用可有效调控正常小鼠及糖尿病小鼠的血糖血脂水平[10−13]，且未见毒副作用[14]，显示出较好的安全性。苦瓜、桑叶等药食同源类中药，安全有效，其共同作用将更有利于脂糖代谢紊乱相关疾病的预防[15−16]。然而，虽然苦瓜、桑叶在调节脂糖代谢中具有重要作用，但两者合用治疗肥胖的相关研究，目前尚未见报道，有待进一步探索。

基于此，本研究将苦瓜、桑叶合用，联合其他几味相同功效药食同源类中药（葛根、金银花等[17−19]），共同制成苦瓜桑叶复合颗粒，以此为研究对象，采用高脂饮食引起的肥胖大鼠模型，进一步考察苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠脂糖代谢及肠粘膜屏障异常的改善作用。通过体重、血糖血脂水平、肝肠组织病理切片及肠粘膜蛋白表达等多方面检测，探讨苦瓜桑叶复合颗粒改善肥胖的作用机制，为苦瓜、桑叶合用制剂的开发及应用提供数据支持及方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级SD大鼠 雄性，体重200～250 g，由河北省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（冀）2018-004；基础饲料、高脂饲料 河北医科大学实验动物中心；RIPA裂解液、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride）、5×蛋白上样缓冲液（还原型）、BCA蛋白浓度检测试剂盒、PBS、BSA、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、吐温−20（Tween-20）、HRP标记的山羊抗兔二抗、Anti-Occludin抗体、Anti-GAPDH抗体 武汉赛维尔生物科技有限公司；苦瓜桑叶复合颗粒 河北康平健康产业有限责任公司。

PL-203电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；JY92-IIn超声细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R台式高速冷冻离心机 力康生物医疗科技控股有限公司；KH-III全自动研磨仪 武汉赛维尔生物科技有限公司；Epoch全波长酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；Chemray 240全自动生化分析仪 深圳雷杜生命科技股份有限公司；RM2135型切片机 德国LEICA公司；CX31型显微镜 日本Olympus公司；Bio-Rad小型垂直电泳转印系统（包括垂直电泳槽、转印芯及基础电源）、ChemiDocTM XRS+凝胶成像系统 美国伯乐公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苦瓜桑叶复合颗粒的制备 苦瓜桑叶复合颗粒由河北康平健康产业有限责任公司制备，配方包括苦瓜、桑叶、百合、山药、葛根、山楂、甜叶菊（质量比为250:150:24:50:60:40:7）。制备步骤如下：称取原料混合，以料液比1:10加入蒸馏水，加热回流提取1.5 h，过滤得滤液，药渣加8倍量蒸馏水加热回流提取45 min，过滤，合并两次滤液，得总提取液。总提取液减压浓缩至相对密度1.09～1.1，加原料量10%的麦芽糊精，喷雾干燥，收集喷雾干燥粉，即得本实验用苦瓜桑叶复合颗粒。

1.2.2 大鼠肥胖模型建立 32只SD雄性大鼠，适应性饲养一周后，随机分为空白对照组、高脂肥胖模型组、苦瓜桑叶复合颗粒低剂量组和苦瓜桑叶复合颗粒高剂量组，每组8只。空白对照组（Control）给予基础饲料，高脂肥胖模型组（Model）及苦瓜桑叶复合颗粒低、高剂量组（Low dosage、High dosage）均喂养高脂饲料（河北医科大学实验动物中心监制；主要成分质量比：猪油11.0%，蛋黄8.0%，胆固醇1.5%及基础饲料79.5%）。苦瓜桑叶复合颗粒低、高剂量组在给予高脂饲料的同时，按照大鼠体重比，每日分别灌胃0.5及1 g/kg苦瓜桑叶复合颗粒，给药8周；空白对照组及高脂肥胖模型组以相同方法灌胃等体积生理盐水。饲养温度20～24 ℃，12 h 明暗轮换。第8周结束后，获取实验材料用于后续分析。

1.2.3 大鼠体重监测 每周记录大鼠体重，自由摄食、饮水。

1.2.4 血糖血脂检测 第8周结束后，所有大鼠禁食不禁水过夜，10%（m/v）水合氯醛腹腔注射（100 μL/10 g）麻醉，腹主动脉取血，室温放置30 min后，3000 r/min离心10 min，收集血清，于−80 ℃保存备用；血糖（葡萄糖、糖化血清蛋白）、血脂（总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇）等生化指标采用全自动生化分析仪测定[20]。

1.2.5 组织形态学观察 取各组大鼠肝脏及结肠组织，经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤制成蜡块。使用轮转式切片机制作大鼠肝脏组织切片及结肠组织切片，对其进行苏木精-伊红染色（HE染色），并通过光学显微镜观察大鼠肝脏及结肠组织形态[21−22]。

1.2.6 大鼠结肠粘膜紧密连接蛋白Occludin检测

1.2.6.1 蛋白样本制备 取结肠样本加入RIPA裂解液（含1% PMSF），使用裂解仪（3 mm×3 mm钢珠，60 Hz，120 s）进行裂解，冰浴孵育30 min，4 °C，12000 r/min离心10 min，取上清，加入5×蛋白上样缓冲液（还原型），体积为蛋白样品的1/4，涡旋后100 ℃水浴5 min，降至室温后置于−20 ℃保存。

1.2.6.2 Western Blot免疫印迹检测 配制10%SDS分离胶，蛋白上样量为20～35 μg，进行SDSPAGE电泳，60～80 V。电泳结束后，将含目标蛋白的SDS胶条带利用湿转法将目标蛋白转移至已经甲醇活化的0.22 μm PVDF膜上，电压为110 V，转膜时间为100 min。PVDF膜转移于5% BSA封闭液中室温振荡封闭2 h。分别加入Anti-GAPDH抗体（1:4000）及Anti-Occludin抗 体（1:3000）室 温 振荡孵育2 h后，4 ℃过夜孵育。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗兔抗室温孵育2 h，按上述方法用TBST洗涤。加ECL显色液利用化学发光凝胶成像系统进行成像。

1.2.6.3 半定量分析 采用Image Lab分析软件对目标蛋白条带进行采集分析，并通过灰度值进行半定量计算。

1.3 数据处理

采用Graphpad Prism 5软件进行数据分析，测定结果以平均值±标准误（Mean±SEM）表示。采用ttest进行各组间差异分析，以P＜0.05为差异显著。与肥胖模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠体重的影响

由表1可知，随着时间的推移，各组大鼠体重均呈增加状态。在第6周后，肥胖模型组大鼠的体重极显著高于空白对照组（P＜0.01）；苦瓜桑叶复合颗粒低剂量组大鼠在第4周后，体重显著低于肥胖模型组（P＜0.05）；苦瓜桑叶复合颗粒高剂量组大鼠在第5周后，体重显著低于肥胖模型组（P＜0.05）。结果显示，苦瓜桑叶复合颗粒低剂量组及高剂量组，均可将高脂饮食引起的体重增加恢复至正常水平，并与空白对照组无显著性差异（P＞0.05）。综上结果表明，苦瓜桑叶复合颗粒可有效控制肥胖大鼠的体重增高现象，提示其对高脂饮食诱导肥胖大鼠的糖脂代谢紊乱现象有潜在调节能力。

表1 桑叶苦瓜复合颗粒对高脂饮食诱导的肥胖大鼠体重的影响（n=8,g）Table 1 Effects of the composite granules of bitter melon and mulberry leaf （CGBM） on the body weight of high-fat diet-induced obese rats （n=8,g）

2.2 苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠血糖及血脂的影响

对各组大鼠的血糖及血脂进行检测，葡萄糖（GLU）、糖化血清蛋白（GSP）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测结果见图1。

图1 苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠血清葡萄糖（A）、糖化血清蛋白（B）、总胆固醇（C）、甘油三酯（D）、高密度脂蛋白胆固醇（E）及低密度脂蛋白胆固醇（F）的影响Fig.1 Effects of CGBM on the serum GLU （A）, GSP （B）, TC （C）, TG （D）, HDL-C （E） and LDL-C （F） in high-fat diet-induced obese rats

结果显示，与空白对照组大鼠相比，肥胖模型组大鼠血清中GLU和GSP含量显著升高（P＜0.05）。给予苦瓜桑叶复合颗粒后，低剂量组及高剂量组大鼠血清GLU和GSP水平显著降低（P＜0.05），并可恢复至正常值。

与空白对照组大鼠相比，肥胖模型组大鼠血清HDL-C含量显著升高（P＜0.05）。给予苦瓜桑叶复合颗粒后，肥胖大鼠血清HDL-C含量有所降低，并可逐步恢复至正常水平。与空白对照组大鼠相比，肥胖模型组大鼠血清LDL-C含量显著降低（P＜0.05）。给予苦瓜桑叶复合颗粒后，肥胖大鼠血清LDL-C含量回升，高剂量下大鼠血清LDL-C水平可恢复至正常值。血清TC、TG含量在各组大鼠间均无显著性差异（P＞0.05）。前期研究指出，苦瓜可下调细胞内PPAR-γ的表达，减少细胞内的脂肪堆积，进而调控并改善肥胖引起的糖脂代谢异常现象[23−24]。其中PPAR-γ是一种脂肪细胞发育的重要调控因子，在脂肪细胞，血管平滑肌细胞等多种细胞中广泛表达[25]，而苦瓜桑叶复合颗粒改善肥胖糖脂代谢紊乱现象的机制亦可能与调控PPAR-γ表达有关，但有待进一步研究。

2.3 苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠肝脏组织形态的影响

肝脏作为机体的代谢器官，在脂肪的合成、转运等多方面具有重要调节作用[26]。将各组大鼠肝脏组织切片进行HE染色，结果如图2所示。肥胖模型组大鼠肝脏组织脂肪滴增多，空泡化加重。给予苦瓜桑叶复合颗粒后，肝脏组织空泡化减轻，脂肪滴减少，肝脏脂肪变性有所改善。高脂饮食易引起脂质代谢动态失衡，导致肝脏摄取游离脂肪酸增加或甘油三酯运转障碍，最终导致甘油三酯堆积在肝脏细胞中，发生肝脏脂肪变性[27]。苦瓜桑叶复合颗粒可减少高脂饮食引起的肝脏脂肪变性现象，再次提示其对调节肥胖大鼠脂质代谢的重要作用。

图2 苦瓜桑叶复合颗粒对大鼠肝脏组织形态的影响（HE染色，200×）Fig.2 Effects of CGBM on the pathological changes of liver tissues in high-fat diet-induced obese rats （H&E staining, 200×）

2.4 苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠结肠粘膜组织形态的影响

各组大鼠结肠粘膜组织切片HE染色结果（图3）显示，空白对照组结肠粘膜层腺体排列整齐、直立、紧贴粘膜肌层。肥胖模型组结肠粘膜腺体形状萎缩，数量减少或消失，腺体间距增大，腺体底部与粘膜下的肌层距离增加。苦瓜桑叶复合颗粒给药组的腺体形状有所恢复，与空白对照组的腺体相似。以上结果表明，高脂饮食引发的肥胖可造成大鼠结肠粘膜形态发生改变，而苦瓜桑叶复合颗粒可改善肥胖大鼠的肠粘膜腺体形态、数量及肌层状态异常，具有较好修复效果。前期研究表明，肥胖可引发人类肠道菌群失调，破坏肠道粘膜屏障，进而引发炎症[28−29]。本研究中苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖引起的肠道粘膜损伤具有保护作用，提示其可能对肠道菌群结构及功能具有一定调节作用。

2.5 苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠结肠粘膜紧密连接蛋白Occludin的影响

通过免疫印迹法（Western blot）对各组大鼠结肠组织紧密连接蛋白Occludin的表达进行半定量检测，结果如图4所示。肥胖模型组大鼠结肠粘膜Occludin蛋白表达量显著低于空白对照组（P＜0.05），而苦瓜桑叶复合颗粒低剂量组及高剂量组均可显著提高大鼠结肠粘膜Occludin蛋白的表达量（P＜0.05），8周后恢复至正常水平。相关研究发现苦瓜粉可明显降低肥胖大鼠结肠粘膜脂代谢相关基因的表达，并显著上调结肠紧密连接蛋白Occludin的mRNA水平[30]，另外桑叶主要成分桑黄酮G亦可缓解LPS诱导的体外肠道上皮屏障损伤[31]。以上结果提示苦瓜桑叶复合颗粒可一定程度上恢复肥胖引起的粘膜屏障损伤，对结肠功能重塑及脂糖代谢有重要调节作用。

3 结论

本研究采取高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型，探讨苦瓜桑叶复合颗粒对肥胖大鼠脂糖代谢及肠粘膜屏障异常的影响。通过8周的干预治疗，苦瓜桑叶复合颗粒可有效降低肥胖大鼠体重，改善肥胖引起的血糖血脂水平失衡现象，调控肥胖大鼠血清GLU、GSP、TC、TG、HDL-C及LDL-C 含量趋向正常。苦瓜桑叶复合颗粒亦可减少高脂饮食引起的肝脏脂肪堆积现象，减少肝脏脂滴产生。肥胖大鼠结肠粘膜完整性受到破坏，腺体损伤伴随着紧密连接蛋白Occludin的表达减少，最终导致肠道屏障作用受损。苦瓜桑叶复合颗粒可改善肥胖引起的肠屏障异常现象，修复肠粘膜腺体、肌层及紧密连接，具有较好肠道保护作用。

苦瓜桑叶等药食同源中药在食品和制药领域的应用仍处于起步阶段，其益处远没有得到充分利用。在确保安全性的前提下，苦瓜、桑叶具有降血糖，降血脂等作用，在开发抗肥胖药物及保健产品方面具有广阔前景[32]。本研究阐述了苦瓜桑叶复合颗粒对高脂饮食诱导的肥胖大鼠疾病状态的改善作用，从脂糖代谢及肠粘膜屏障等方面探讨了其作用机制，可为后续苦瓜桑叶复合颗粒相关制剂的开发及机制研究提供数据支持及方法参考。