世界卫生组织《关于更新使用结核分枝杆菌及其耐药性核酸扩增检测技术的建议》的启示

夏辉 赵雁林

快速、准确的实验室诊断对于发现结核病患者、确定有效治疗方案、获取良好治疗效果，以及阻止结核病在社区中的传播至关重要。过去十几年，结核病新诊断技术的研发取得了显著进展,世界卫生组织已经推荐了若干新型结核病诊断技术。2021年2月 18日，世界卫生组织发布了《关于更新使用结核分枝杆菌及其耐药性核酸扩增检测技术的建议》(简称《建议》)(UpdateontheuseofnucleicacidamplificationteststodetectTBanddrug-resistantTB:rapidcommunication)[1]。此文件的发布与更新表明，在结核病及耐药结核病的诊断领域又有了新的进展和更多可选择的工具，在原来推荐的如多色半巢式荧光定量PCR、微流体芯片技术、环介导等温扩增法、线性探针耐多药及二线抗结核药物耐药性检测技术等的基础上[2]又提供了更多可选择的技术和产品。这些技术和产品的实验数据呈现出了较好的诊断效能，为进一步推广应用带来新的前景。笔者就世界卫生组织《建议》的产生背景、涉及技术的特征、性能指标，以及我国结核病防治规划实施中相关领域需要关注的问题和启示进行阐述，供业内人士参考。

一、背景

该文件在发布前通过系统综述分析了目标技术或产品的技术指标和成本等，并根据PICO(PICO是基于循证医学理论将信息格式化的检索方式，为Participants, Interventions, Comparisons, Outcomes的缩写)原则，确定技术指标(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)、用途、预期达到的目的，以及与其他检查方法的可比性及区别等。由于在系统综述过程中未查询到所列技术的成本效果分析，该《建议》中描述的成本分析主要是基于前期类似技术已发表研究结果或单一仪器或试剂的成本。该《建议》的形成是通过全球专家组咨询，并结合系统综述中的技术指标、成本及操作简易程度、可接受性、公平性、可获得性等进行综合判断，最终给出应用建议。

二、推荐的产品技术

目前世界卫生组织结核病诊断评估机制是为了评估各类结核病诊断技术，不再针对特定产品。以前世界卫生组织在推荐使用各种产品和技术时往往是单个产品的推荐，主要是囿于当时可用的技术种类有限。随着生物技术产品的日益增多，世界卫生组织不再推荐单一的、某一种特定产品，而是对技术进行了归类，主要依据操作的复杂程度和手工操作步骤的多寡，将核酸扩增检测技术(nucleic acid amplification tests， NAAT)进行了归类，分别命名为低度复杂程度自动化核酸扩增检测技术(low complexity automated NAAT))、中度复杂程度自动化核酸扩增检测技术(moderate complexity automated NAAT)及高度复杂程度核酸杂交检测技术(high complexity hybridization-based NAAT)。这些定义描述了技术的类型(如基于自动化的或杂交的NAAT)及操作的复杂程度(依据所需设施、设备及技术要求等区分低度、中度或高度复杂程度)。需要注意的是，该《建议》所列出的复杂程度仅作为指导这些技术产品具体应用时所考虑的其中一种因素，其他包括但不限于诊断准确性、应用地区的结核病及耐药结核病流行病学特征、实施层面的因素(结果报告周期、检测通量、现有检验设施和实验室网络等)、成本，以及技术的可接受性、公平性、终端应用的价值和用户使用偏好等因素。

该《建议》内定义的低度复杂程度自动化核酸扩增检测技术目前只纳入了赛沛的Xpert MTB/XDR，该方法是基于10色荧光通道的多重PCR技术，需要注意的是Xpert MTB/XDR并不能直接使用原有的GeneXpert仪器平台，需要对仪器核心模块进行更新或者重新购买仪器。其完成检测1份样本约需90 min，需要手工操作的步骤非常少。此外，因世界卫生组织于2020年10月对广泛耐药结核病(XDR-TB)的定义进行了修订和更新[3]，准XDR-TB (Pre-XDR-TB)定义为满足耐多药/利福平耐药结核病(MDR/RR-TB)且同时对任一氟喹诺酮类药物耐药，XDR-TB定义为满足MDR/RR-TB且同时对任一氟喹诺酮类药物耐药并至少对其他A组抗结核药物中的一种药物耐药。故使用Xpert MTB/XDR并不意味着可以检测新定义下的XDR-TB患者，该方法目前也不能检测贝达喹啉、利奈唑胺及其他可能归入A组的药物。

《建议》内定义的中度复杂程度自动化核酸扩增检测技术目前包含4个平台的产品，分别是雅培(RealTime MTB和RealTime MTB RIF/INH)、海恩生命科学(MTBDR和FluoroType MTB)、碧迪(MAXTMMDR-TB)和罗氏(MTB和MTB-RIF/INH)的产品技术。这些产品仅可用于诊断结核病、利福平及异烟肼耐药。此处“中度复杂程度”主要依据涉及的自动化核酸提取、自动化PCR扩增、自动化结果读取几个步骤之间无需或只有1个移液步骤。在将检测标本加入到试剂盒之前，此类“自动测试”仅需初始标本处理时的手工操作，开展此类技术的实验室应满足并采取一定的生物安全防护措施并配备特定设备，此外还需要训练有素、操作熟练的实验室人员来进行检测并完成仪器维护要求等。 此类技术包含的4种产品虽均为自动化产品，但自动化程度及结果报告周期不尽相同，详细对比情况见表1[4]。4种产品较之前世界卫生组织推荐的基于手工操作和人工判读结果的线性探针技术在操作复杂性方面有了很大改进。

表1 中等复杂程度自动化核酸扩增检测技术不同产品对比情况

高度复杂程度核酸扩增杂交检测技术目前只包含了用于吡嗪酰胺耐药诊断的尼普洛(日本)的Genoscholar PZA-TB Ⅱ方法。其操作与结果判读与手工线性探针技术类似，操作繁琐，人工操作步骤多，尤其是结果判读完全依赖人工判读，且因吡嗪酰胺耐药相关基因pncA突变位点散布于整个基因，缺乏明显的集中突变区域，故需要判读的条带多且复杂，因此结果判读受人为因素影响较大。

本次世界卫生组织更新的《建议》虽根据复杂程度将不同的产品进行了大致的归类，但每大类都包含了特定的诊断产品技术，不代表其他技术可以自动归入相应的类别，任何新的同类别产品技术都需要开展具体评估后追加更新到相应的类别。

三、耐药性检测的药物种类

现有的3种归类法除了操作复杂程度外还区分了检测技术的应用范围，如对结核分枝杆菌和抗结核药物耐药性的检测。原有的世界卫生组织推荐的技术如Xpert MTB/RIF虽然在全球应用最广泛，但仅能检测利福平耐药性。线性探针技术既有针对利福平和异烟肼的检测产品，也有针对氟喹诺酮类及二线注射类药物的耐药性检测产品，但由于线性探针技术自动化程度较低，使得应用该技术的实验室相对较少。

该《建议》中的低度复杂程度自动化核酸检测技术Xpert MTB/XDR法可同时检测异烟肼、氟喹诺酮类药物、二线注射类药物以及乙硫异烟胺相关的耐药基因突变。中度复杂程度的自动化核酸扩增检测技术目前仍仅针对结核分枝杆菌及对利福平和异烟肼的耐药性检测。高度复杂程度的Genoscholar PZA-TB Ⅱ仅可用于检测吡嗪酰胺耐药性，这也是目前唯一的一个用于检测吡嗪酰胺耐药性的分子生物学检测技术。

四、三类技术的诊断效能

1． 低度复杂程度的自动化核酸扩增检测技术诊断效能:包含3项研究的1605份样本的系统综述结果显示，对在细菌学确诊的肺结核患者，以表型药物敏感性试验为参考，在痰标本中检测异烟肼耐药的汇总敏感度为94.2%(95%CI：89.3%～97.0%)，汇总特异度为98.0%(95%CI：95.2%～99.2%)；检测氟喹诺酮类药物耐药的汇总敏感度为93.1%(95%CI:88.0%～96.1%)，汇总特异度为98.3%(95%CI：94.5%～99.5%)；检测阿米卡星耐药的汇总敏感度为89.1%(95%CI：80.9%～94.1%)，汇总特异度为99.5%(95%CI：96.9%～99.9%)。因乙硫异烟胺的表型药物敏感性试验的准确性欠佳，故以inhA启动子区测序作为检测乙硫异烟胺耐药性的参考标准，乙硫异烟胺耐药检测的汇总敏感度为96.4%(95%CI：92.2%～98.3%)，汇总特异度为100.0%(95%CI:82.5%～100.0%)。

2．中度复杂程度的自动化核酸扩增检测技术诊断效能:包含32项研究的16 726份样本的系统综述结果显示，以分离培养为标准，中度复杂程度的自动化核酸扩增检测技术检测结核分枝杆菌的汇总敏感度为93.0%(95%CI：90.9%～94.7%)，汇总特异度为97.7%(95%CI：95.6%～98.8%)。以表型药物敏感性试验为标准，检测利福平耐药的汇总敏感度为96.7%(95%CI：93.1%～98.4%)，汇总特异度为98.9%(95%CI：97.5%～99.5%)；检测异烟肼耐药的汇总敏感度为86.4%(95%CI：82.8%～89.3%)，汇总特异度为99.2%(95%CI：98.1%～99.7%)。

3．高度复杂程度的核酸扩增杂交检测技术诊断效能：包含7项研究的964份样本的系统综述结果显示，以表型药物敏感性试验为标准，细菌学确诊肺结核患者分离株中，检测吡嗪酰胺耐药的汇总敏感度为81.2%(95%CI：75.4%～85.8%)，汇总特异度为97.8%(95%CI：96.5%～98.6%)。

五、对我国结核病防治的启示

1．基于循证医学证据结合广泛代表性的专家论证是科学决策的有效方法：世界卫生组织的技术文件通常都是在系统文献综述的基础上，召集有代表性的专家，根据PICO原则，确定相关指标，并基于循证医学证据和专家论证意见，形成具有通用性和普遍性的技术推荐意见。基于循证医学证据的科学决策方法值得我们学习和效仿，也需要在此基础上，根据具体国情制定符合我国国情的技术措施和技术对策。

2．应用创新诊断工具是结核病精准诊断及治疗的有效手段：由过去仅能检测抗酸杆菌的涂片镜检发展到可以快速准确检测结核分枝杆菌的分子生物学检测技术，由仅能通过结果报告周期约2～3个月的表型药物敏感性试验到自动化针对多种药物的分子生物学耐药基因检测，甚至是基因组学预测耐药。结核病实验室检测技术的创新和进步推动了结核病的精准诊断和治疗方案的选择。《建议》中的低度复杂程度的Xpert MTB/XDR法可以快速、准确的提供除利福平之外其他几种药物的耐药性检测。该方法适用于县(区)级应用，可以有效将耐药结核病的诊断关口前移，对耐药结核病的诊断及后续更加精准的治疗产生促进作用。而异烟肼耐药性结果的及时获得可以准确诊断MDR-TB，而不是目前的以RR-TB替代MDR-TB。异烟肼敏感性的及时获得对于我国预防性治疗方案的选择亦发挥作用。左氧氟沙星及莫西沙星作为MDR/RR-TB治疗中的A类药物，在组成有效治疗方案及保护贝达喹啉等其他药物发生获得性耐药中也发挥着作用[5-6]，乙硫异烟胺及吡嗪酰胺均归类为治疗MDR/RR-TB的C组药物，在无法获得其他药品如贝达喹啉、德拉玛尼、利奈唑胺时仍考虑使用[7]，故通过Xpert MTB/XDR-TB及快速、准确地获得氟喹诺酮类及其他药品耐药结果，对于更加精准地制定治疗方案十分有意义。精准及有效治疗方案的组成有助于杀灭患者体内结核分枝杆菌，对于患者个体可以提高治愈率，对于人群而言有助于减少耐药结核病的传播。

《建议》中的低度复杂程度及中度复杂程度的自动化核酸扩增检测技术将有助于其更快地在结核病防治规划中的高质量扩展。

3.多种创新工具的出现需要因地施策和应用：世界卫生组织将在2021年更新的《结核病整合指南模块3诊断-结核病快速检测》中发布关于检测结核病和耐药结核病的核酸扩增检测技术的最新政策指南。虽然《建议》中所列技术均未获得我国相关部门的批准，我们也需要提前考虑如何有效地在结核病防治规划中应用这些技术或同类技术，不同的地区可根据本地异烟肼及氟喹诺酮类药物的耐药率、疾病负担、不同层级的实验室能力及设施等制定适宜的策略。若两种药物的耐药率较高，则迫切需要加强基于自动化核酸扩增检测技术的广泛应用，可以考虑在县(区)级应用Xpert MTB/XDR。相反，若耐药率低，则在经费有限的情况下短期内可维持现有诊断流程，即在地市级采用快速耐药基因检测方法检测MDR/RR-TB，后续用表型药物敏感性试验方法检测其他药物耐药。在地市级使用这些技术，仍然存在标本转运延误、诊断延误、患者失访等风险，因此要加强如标本转运、患者管理、结果反馈等配套措施的建立和有效运行。但从结核病控制的角度，还是应尽快推广应用这些自动化的核酸扩增耐药检测技术，尽可能提供快速准确的耐药性诊断。

实施层面各地需要相应的政策支持，如各地物价的申请、医保政策的支持等。对于使用Xpert MTB/RIF的地方，使用Xpert MTB/RIF时，除了试剂成本外，亦需要进行重新更换模块及校准[8]。若引入新的中度复杂程度自动化核酸扩增检测技术，需要新的设施、设备和试剂，实验室人员和临床医生培训，以及新的质量保证系统等。

4．开展基础与实施性研究进一步创新和改善诊断工具：《建议》中的几种技术虽在呼吸道样本中显示出较高的敏感度，但在不同国家、区域和不同临床标本中的性能，在HIV感染者和儿童中的效能，在肺外样本中的诊断效能尚未进行大范围评估[9-10]，在我国更是缺乏相应研究和数据。

一些突变频率较低的位点并没有纳入作为异烟肼及氟喹诺酮类药物耐药检测的靶标序列[9，11]，可能在某些区域造成较低的敏感度。目前尚无基于分子生物学的贝达喹啉、德拉玛尼等新药的耐药检测技术，需要进一步开展基础研究和应用型研究以创新及改善现有诊断工具。

中度复杂程度的4种产品迫切需要补充对其他药物的耐药性检测。用于吡嗪酰胺耐药检测的高度复杂程度核酸扩增杂交技术的操作仍过于复杂，仍需提升自动化水平。

我国同等功能的技术，需要范围更广的评估和验证，从而推动我国自主知识产权产品技术的进一步发展和应用。