Xpert MTB/RIF Ultra在儿童结核病诊断中的应用进展

王亚翠 孙琳 申阿东

儿童结核病存在较多漏诊和误诊且死亡率相对较高，因此，儿童结核病的防控面临着很大的挑战。目前，儿童结核病诊断的传统实验室检测方法如抗酸染色、固体培养或液体培养，敏感度低且耗时长。另外，儿童结核病大多数为原发性肺结核，标本的菌载量较低且不易采集，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)培养和涂片检查阳性率低，导致儿童结核病早期诊治相对困难。因此，研发更加快速、敏感的检测方法对儿童结核病的早期诊断和及时治疗至关重要。

GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)是世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐用于结核病早期诊断和利福平耐药检测的分子诊断技术。Xpert检测技术具有较高的敏感度和特异度，并且能够准确、快速检测出MTB及其对利福平的耐药性。因此，该技术广泛应用于肺结核和肺外结核的诊断。尽管Xpert检测技术具有较高的敏感度，但是在含菌量较少的患者(如儿童结核病患者)中的检测敏感度较低[1-2]，并且对不同类型的肺外结核标本检测敏感度差别较大[3]。为了进一步提高Xpert检测技术的敏感度，新一代的Xpert MTB/RIF Ultra(简称“Xpert Ultra”)检测技术被研发并应用。该检测技术已经开始应用于成人结核病检测，并且多项研究结果证明其诊断成人结核病的敏感度优于Xpert检测[4-8]。目前，Xpert Ultra检测技术在儿童结核病诊断中的研究相对较少，为此，笔者对其在此方面的研究及应用进展进行综述。

一、Xpert Ultra与Xpert技术原理对比

2017年3月，WHO推荐使用新一代的检测方法Xpert Ultra替代Xpert，旨在提高检测敏感度。与Xpert相比，Xpert Ultra检测技术的PCR扩增体系由原来的25 μl增加至50 μl，并且在Xpert检测单个ropB目的基因的基础上增加检测2种多拷贝序列IS6110和IS1081。这些技术的改进使Xpert Ultra对MTB的检出下限由原来的112.6 CFU/ml下降为15.6 CFU/ml，与Xpert相比敏感度提高了7倍[9-10]。此外，Xpert Ultra检测原理由半定量半巢式循环阈值比较变为半定量巢式PCR，并采用了高分辨率熔解曲线技术。改善了Xpert检测ropB基因突变类型中“沉默突变”错误报阳的情况，重新设计了ropB基因的分子信标，提高了利福平耐药相关第553位密码子突变检测能力，以及使Q513Q、F514F沉默突变与其他利福平耐药相关的决定区域的突变得以区分，从而更好地区分ropB突变种类及在混合感染时检测利福平耐药情况。Xpert Ultra检测技术的另一个优势是检测时间明显缩短，报阳和报阴时间由Xpert的110 min分别缩短至77 min和66 min，从而有利于患者的快速诊断和及时采取治疗措施[11]。

二、Xpert Ultra对儿童结核病诊断的敏感度

(一)Xpert Ultra检测不同类型标本的敏感度

Xpert Ultra检测不同类型临床标本的效能不同。在儿童结核病诊断中检测的标本类型包括痰液、胃液、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、鼻咽抽吸物、粪便等。目前以痰标本Xpert Ultra检测开展的研究最多。研究表明，在呼吸道样本中，Xpert Ultra检测BALF的敏感度最高，胃液和痰液次之，鼻咽拭子较低[12-16]。痰液是肺结核诊断应用最广泛的呼吸道样本类型。以痰标本MTB培养结果为金标准，Xpert Ultra检测痰标本诊断肺结核的敏感度为58%～75%[12-13，15，17]；Meta分析结果显示，Xpert检测痰标本诊断肺结核的汇总敏感度约为62%[1]。Sun等[14]研究显示，以MTB培养或涂片抗酸染色镜检结果为金标准时，Xpert Ultra检测BALF标本诊断肺结核的敏感度可达91%。Zar等[15]研究显示，以痰培养结果为金标准，Xpert Ultra检测鼻咽抽吸物诊断肺结核的敏感度为46%。在消化道样本中，已有很多研究报道了胃液Xpert检测在儿童结核病诊断中的准确性[18-23]。Detjen等[1]荟萃分析显示，Xpert检测胃液标本诊断肺结核的汇总敏感度为66%。Sun等[16]研究显示，以MTB培养结果为金标准，Xpert Ultra检测儿童胃液标本诊断肺结核的敏感度可达87.5%。两项研究评估了Xpert Ultra检测儿童粪便标本诊断肺结核的临床应用价值。Kabir等[24]研究显示，以痰MTB培养结果为金标准，Xpert Ultra检测儿童粪便标本诊断肺结核的敏感度优于Xpert(88.9%vs77.8%)；该研究中粪便标本Xpert Ultra阳性的检测结果中80%为“痕量(trace)”。Liu等[25]研究显示，Xpert Ultra检测粪便和呼吸道样本的一致性可达84.1%，检测粪便样本诊断儿童肺结核的敏感度为45.5%，与细菌学培养敏感度相同。一篇纳入9项研究的Meta分析显示，Xpert检测粪便标本诊断儿童肺结核的汇总敏感度为67%[26]，与检测痰标本的诊断敏感度(62%)相当[1]。

(二)Xpert Ultra诊断培阴涂阴结核病的敏感度

既往研究显示，结核病患儿培养阳性率约为30%～40%[27]，抗酸染色镜检阳性率仅为6.8%[28]。因此，在儿童结核病中也会存在一定比例的培阴涂阴患者。涂阴患者也具有传染性，约有10%～20%结核病患者的传播来源于涂阴患者[29]，并且由于缺乏细菌学证据导致误诊误治，从而使涂阴患者的病死率高达20%[30]。加强该部分患儿的早期快速诊断，对于及早诊治尤为重要。目前，关于Xpert Ultra检测技术在涂阴结核病患者中的应用多集中于成人，Xpert Ultra诊断成人培阳涂阴肺结核患者的敏感度优于Xpert，较Xpert提高了13%～25%[4-5，10]。Sabi等[13]研究显示，在Xpert Ultra和Xpert诊断儿童涂阴肺结核的敏感度分别为44.4%和27.8%，Xpert Ultra的诊断敏感度明显高于Xpert。由上述研究结果可知，Xpert Ultra诊断敏感度相对较好，有助于患儿的早期诊断和早期治疗，控制疾病的进展。

(三)Xpert Ultra检测MTB/HIV双重感染的敏感度

结核病是艾滋病患者最常见的机会感染之一，约占20%～50%，艾滋病患者结核病发病率是正常人的30倍[31]。艾滋病并发结核病患者死亡率较高，特别是儿童患者，免疫损伤更严重，导致MTB广泛播散、病情进展更快和临床表现复杂。因此，早期诊断并及时治疗对降低此类患者的死亡率至关重要。Xpert和Xpert Ultra被推荐用于MTB/HIV双重感染的检测。2014年WHO出版的《国家结核病规划关于儿童结核病处理指南》建议，对疑似HIV感染的结核病患儿，Xpert可先于培养法和抗酸染色法作为初筛方法[32]。Meta分析显示，Xpert诊断儿童结核病并发HIV感染的汇总敏感度为70%[1]。Sabi等[13]研究表明，Xpert Ultra检测该类患者的敏感度更高，较Xpert增加了19%。

三、Xpert Ultra诊断儿童结核病的特异度

Xpert Ultra检测在敏感度增高的同时不可避免地会引起特异度降低[33]。该检测方法的特异度受检测地区结核病发病率及患病人群的影响。在结核病发病率低于100/10万的国家或地区，Xpert Ultra检测的特异度为99%；在结核病发病率高于100/10万的国家或地区，其检测特异度为95%[2]。结核病发病率高的地区人群有既往结核病病史的比例高，Xpert Ultra因其检出限较低能够检测到既往感染者体内残存少量的MTB核酸，从而导致其检测特异度降低。Xpert Ultra检测各种类型标本用于诊断儿童结核病时，其特异度较为接近，为96.9%～99.4%[12-16]，高于其在成人检测中的特异度[4]。这可能与成人既往结核病病史比例高于儿童有关(21%vs7%)[33]。

四、Xpert Ultra在实际应用中的要点

(一)不同类型标本检测的处理流程及影响因素

痰液、鼻咽抽吸物、BALF的处理流程类似，加入标本处理液后振荡并室温孵育后，加入试剂盒进行检测。胃液标本因为pH值较低，需要加入等体积1.5%的氢氧化钠中和胃酸；振荡并室温孵育，离心后的沉淀添加标本处理液并加入试剂盒进行检测。粪便标本因含有较多的杂质，与其他标本处理步骤不同。待测粪便标本加入粪便处理液、标本处理液和玻璃珠振荡混匀并室温孵育，混合物过滤后才能加入试剂盒进行检测。

如采集的标本10 d内进行检测，则建议放在2～8 ℃冷藏。如长期储存则建议冷冻保存。在加入标本处理液之后，如不能立即处理则需要放2 ℃～8 ℃冷藏，并于4 h内加入试剂盒进行检测；如果加入试剂盒后，则需要在30 min内上机检测。标本的储存时间是否会影响检出率也存在一些不一致的结论。例如，Singh等[34]认为，随着胃液储存时间延长，Xpert检测的阳性率也下降，在冷冻储存650～849 d内，其阳性率为77.1%，而超过1050 d后其阳性率降至50%。但该研究结果也提示，即使采用冷冻存放4年以上的胃液标本，其检出率也可以达到50%。这可能与分子生物学方法较高的敏感度有关。尽管如此，在有条件的情况下，采集标本后尽快进行检测有助于保证标本的检出效率。

(二)不同类型样本的选择和联合应用

呼吸道样本中以痰液、BALF、鼻咽拭子使用较多。由于痰标本采集具有无创性，大年龄、能够自主咳痰儿童可优先选择采用痰液进行检测。但是大多数情况下，儿童肺结核患者痰标本获取难度大，不合格率高且含菌量较少，因此，临床广泛探索其他呼吸道标本用于Xpert Ultra检测，以期提高检出率。在符合气管镜检查指征且行支气管肺泡灌洗的结核病患儿中，BALF也是非常有效的检测标本。但BALF的采集受医院资源设备、医生技术水平等多种因素的影响，在基层医院和疾病高负担国家和地区应用受到一定的限制。另外，鼻咽抽吸物相对容易获取，也可作用无痰患儿的补充样本。

除外呼吸道样本，消化道样本中胃液和粪便也是儿童结核病诊断的重要样本类型。儿童因其生理特点无法咳出呼吸道分泌物，而通过吞咽活动将含有MTB的分泌物吞咽入消化道，在其胃液和粪便标本中可检测到MTB，因此，适用于排痰困难的儿童。胃液一直被国内外推荐作为住院儿童进行病原体检测的标本类型。例如，德国50%以上的肺结核患儿都是采用胃液MTB培养得以确诊[35]。Meta分析和临床研究的数据也都显示，Xpert和Xpert Ultra检测胃液、粪便与呼吸道标本的敏感度接近，甚至略高，均在60%以上[1，25-26]。研究显示，消化道标本检出的阳性率随年龄逐渐下降[16，35]，在小于1岁患儿中检出率最高[35]，提示胃液标本在咳痰困难的小年龄患儿中诊断价值更高。

因此，Xpert Ultra检测技术用于儿童肺结核诊断时，首先应考虑无创性痰标本和鼻咽抽吸物进行检测。如果患儿不能自主排痰，或者痰液标本质量无法达到检测要求时，可选择胃液标本。其次，粪便标本也是很好的补充标本类型，但目前仍需要进一步的验证。在满足纤维支气管镜检查适应证且条件允许时，可考虑BALF检测。

Zar等[15]指出，2次鼻咽抽吸物取样用于Xpert Ultra检测可将其敏感度增加至54%；单次痰标本联合单次鼻咽抽吸物进行检测，Xpert Ultra的敏感度可高达80%；单次痰标本联合2次鼻咽抽吸物进行检测，Xpert Ultra的敏感度可升高至87%。虽然Xpert Ultra检测鼻咽抽吸物的敏感度低于痰标本，但是多次取样及联合多种不同类型标本进行检测也可以提高其对MTB的检出率。因此，针对诊断困难的儿童结核病患者，尤其是培阴涂阴结核病和结核病并发HIV感染的患儿，选择敏感度高的分子生物学方法可提高检出率，而且多次取样和联合多种标本同时进行检测也可有效提高其诊断效能。

(三)Xpert Ultra的痕量结果判读

Xpert Ultra检测结果在Xpert的基础上增加了“痕量”这一项。“痕量”结果被认为是导致Xpert Ultra检测特异度降低的主要原因，通常代表无活力的细菌，尤其在有近期结核病病史的人群中[9]。然而，由于儿童结核病患者MTB载量较低，在儿童中Xpert Ultra检测结果为“痕量”的患者多数可诊断为结核病[13-15]。成人有结核病病史的比例高于儿童，如果将成人Xpert Ultra检测为“痕量”患者视为阳性，则容易出现假阳性。为了解决这一问题，研究者将Xpert Ultra 检测“痕量”结果给出了3种解读方案：一是直接将该检测结果划分为阴性结果；二是将有结核病病史且出现“痕量”结果的患者视为阴性；三是重新采集标本再进行Xpert Ultra检测，如果第2次检测结果为阴性则视为阴性患者，如果第2次检测结果为阳性则视为阳性患者[4]。研究表明，第1种方案的Xpert Ultra检测特异度最高，但是以该分类分析Xpert Ultra检测敏感度也会随之下降；第2、3种方案在提高Xpert Ultra检测特异度的同时也维持了相对较高的敏感度[4]。

综上所述，Xpert Ultra检测可以明显提高儿童结核病患者，以及临床难以诊断的涂阴肺结核患者、结核病并发HIV感染等载菌量较低患者的检出率。目前，在儿童群体中Xpert Ultra检测主要应用于肺结核的诊断，并且当前所用标本多为呼吸道标本和胃液标本。未来，还需要评估Xpert Ultra用于肺外结核诊断的临床应用价值，探讨其对不同类型标本的检测效能。