UPLC-Q/TOF-MS结合UNIFI库快速分析西洋参茎叶三醇皂苷

史大臻，赖思含，刘俊彤，付东兴，谭璐瑩，王彩霞，周柏松，李平亚，吴福林

（吉林大学药学院，吉林 长春 130021）

西洋参（Panax quiquefolium L.）又称花旗参，属五加科人参属植物，是一种名贵的植物药材，其根为西洋参的传统药用部位。近年来，有研究[1-3]发现西洋参的上部分，特别是其茎叶作为新的药用部位，具有重要的药用价值。西洋参茎叶中主要活性成分为皂苷类成分，西洋参茎叶总皂苷具有增强心血管系统功能[4]、中枢神经系统保护[5]、抗炎[6]和抗氧化[7]等重要药理作用，其中，三醇皂苷：人参皂苷Re、-Rg2、-Rg1、-Rh1和-PPT，伪人参皂苷PF11、-RT5；奥克梯隆也具有抗癌[8]、降血糖[9]、肝保护[10]和抗胃溃疡[11]等生物活性。曹霞和田刚等[12,13]人研究表明，西洋参茎叶三醇皂苷可通过降低血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH），丙二醛（MDA）含量及提高超氧化歧化酶（SOD）活性，来减小心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死范围（MIS），发挥心血管系统保护作用。同属植物三七的三醇皂苷已被开发为具有活血化瘀功能的二类中药三七通舒胶囊[14]。综上，可以推断西洋参茎叶三醇皂苷具有潜在的药用价值，本课题组前期已从总皂苷中高效制备了三醇皂苷，并获得国家授权发明专利（CN98100070.3）[15]，成功分离并鉴定了9个三醇皂苷[16]。

超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术（UPLCQ/TOF-MS）具有灵敏、分辨率高和分析速度快等优点，已经成为天然药物中活性成分分离与鉴定的重要手段。UNIFI天然产物分析数据库包括从600余种中药中发现的6 000多种化合物信息，能将数据采集、分子式确定、峰提取、数据库检索及报告生成相结合，以此对化学成分进行快速、准确地定性分析[17,18]。近年来，本课题组利用UPLC-Q/TOF-MS与UNIFI数据平台相结合，快速分析鉴定出了人参、西洋参、桔梗和辣木叶等的化学成分[18-20]。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技术结合UNIFI数据分析平台，对西洋参茎叶三醇皂苷化学成分进行快速、全面地分析与鉴定，为其药效物质基础与质量控制提供依据，同时也为后续针对西洋参茎叶三醇皂苷的药物开发提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器与装置

Xevo G2-XS型Q-TOF四级杆飞行时间质谱仪、AC-QUITY UPLC二元泵和样品管理器、UNIFI科学信息学系统V1.7（美国Waters公司）、TGL-16aR型飞鸽超速离心机（上海安亭科学仪器厂）、R501型旋转蒸发仪（上海豫康科教仪器设备有限公司）、FA1104N型电子天平（上海民侨精密科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

西洋参茎叶三醇皂苷，实验室自制，淡黄色粉末（总皂苷含量80%）。人参皂苷Re、-Rg2、-Rg1、-Rh1、-Rf、-F1，拟人参皂苷RT5、-F11、奥克梯隆对照品，均购自中国药品生物制品鉴定所。乙腈（美国Fisher公司，色谱级）；甲酸钠、亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma公司，色谱级）；水为屈臣氏纯净水。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备

取西洋参茎叶三醇皂苷适量，用80%甲醇1 mL溶解，制成浓度约为0.05 mg/mL的供试品溶液，过滤（0.22m膜），备用。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称定对照品人参皂苷Re、-Rh1、-Rg2、-Rg1、-Rf、-F1，拟人参皂苷F11、-RT5、奥克梯隆适量，加入甲醇溶解，定容至100 mL，制备成浓度约为2.0 mg/mL（最高2.8 mg/mL，最低1.1 mg/mL）的混合对照品溶液，备用。

2.3 检测条件

2.3.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm 2.1 mm，1.7m）；柱温30℃；样品管理器温度15℃；进样体积10L；流速0.4 mL/min；流动相：0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)；洗脱梯度：0~2 min，10%B；2~26 min，10%→90%B；26~28 min，90%B；28~29 min，90%→10%B；29~30 min，10%B。

2.3.2 质谱条件 Xevo G2-XS Q-TOF质谱仪，电喷雾电离源（ESI），源温度120℃；去溶剂化温度300℃；毛细管电压2.6 kV（ESI+）或2.2 kV（ESI）；锥孔电压40 V；脱溶剂气流量800.0 L/h；锥孔气流量50 L/h。在MSE模式下，低能通道和高能通道能量分别设置为6 V和20~40 V；质谱仪用100~1 500 Da的甲酸钠校准；所使用的实时校正液亮氨酸-脑啡肽（m/z 556.2771[M+H]+，m/z 554.2615[M-H]﹣）为实时校正标准液（Lock SprayTM，100 ng/mL，15L/min），使用MasslynxTMV4.1工作站以MSEcontinuum模式采集数据。

2.4 数据采集与处理

首先，查阅有关西洋参皂苷类化学成分的相关文献报道，汇总化学成分结构式，并以mol.文件格式导入UNIFI分析平台中，作为UNIFI分析平台自带的传统中药数据库的补充；其次，将LC-MS原始数据以Waters Compression and Archival Tool v1.10软件进行压缩；第三，应用UNIFI数据库软件自动筛查、鉴定化合物，代替传统的人工提峰、计算分子式以及分析碎片断裂情况；第四，创建过滤筛选方法，即设定质量误差为5 mg/kg，且响应值大于3 000；最后，通过结合碎片离子理论精确质量数、相对保留时间和分子式匹配软件Elemental composition、化合物结构匹配软件MassFragment、离线及在线质谱数据库（PubMed,Mass Bank,Chemspider,METLIN）及相关文献对各主要化合物进行人工识别和确认。

3 结果

在西洋参茎叶三醇中共检测到31个三萜皂苷类成分，其中20位碳侧链未发生变化的21种，20位碳侧链发生变化的10种。ESI+、ESI模式下的质谱基峰离子流图见图1。化合物鉴定结果见表1。由西洋参茎叶三醇中鉴定出皂苷类化合物结构图见图2。

图1 PQTS在ESI+、ESI模式下的基峰离子流图Fig.1 The base peak ion chromatograms of PQTS in ESI+and ESI

图2 PQTS中鉴定出的皂苷类化合物结构式Fig.2 The structural formulas of saponins identified in PQTS

表1 PQTS中皂苷类成分的UPLC-Q-TOF/MS鉴定结果Table 1 The UPLC-Q-TOF/MS identification results of saponins in PQTS

续表1

续表1

3.1 20位碳侧链发生变化的三醇皂苷鉴定

20位碳侧链发生变化的三醇皂苷多为奥克梯隆型皂苷，奥克梯隆型三萜皂苷（元）是西洋参相比于人参特有成分[21]，也是西洋参茎叶三醇中的标志性成分。根据文献报道，奥克梯隆型三萜皂苷具有神经系统保护[22]，提高心血管系统功能[23]、抗癌[24]、治疗胃溃疡[25]等多种药理活性，是西洋参茎叶三醇发挥抗心肌缺血作用的重要活性成分。基于UNIFI数据库分析的裂解碎片信息，结合对照品对比及化合物相关参考文献的质谱数据对比的方法，鉴定出奥克梯隆型三萜皂苷（元）9个，其他构型皂苷1个。下面以化合物14和16为例，解析其鉴定过程。

（1）化合物14：在ESI模式下，化合物14的保留时间为9.52 min，准分子离子峰m/z 845.528 8[M+HCOO]，799.518 1[M H]，主要产生1个碎片离子，即653.453 9[M H-Rha]，与伪人参皂苷F11对照品基本一致，再结合文献报道[26]，可将其鉴定为伪人参皂苷F11。伪人参皂苷F11对照品与化合物18的MS/MS图见图3。

（2）化合物16：在ESI模式下，化合物16的保留时间为9.80 min，准分子离子峰m/z 699.493 4[M+HCOO]主要产生2个碎片离子，即m/z 635.473 0[M H-H2O]、m/z 491.412 3[M H-Glu]，与伪人参皂苷RT5对照品的碎片离子基本一致，再结合文献[27]报道，可将其鉴定为伪人参皂苷RT5。伪人参皂苷RT5对照品与化合物16的MS/MS图见图4。

图4 ESI模式拟人参皂苷RT5与化合物16的MS/MS图Fig.4 The MS/MS spectra of pseudo-ginsenoside RT5 and compound 16 in the ESI mode

3.2 20位碳侧链发生未变化的三醇皂苷鉴定

20位碳侧链发生未变化的三醇皂苷鉴定为原人参三醇皂苷（元），原人参三醇皂苷（元）是西洋参茎叶三醇中的主要成分，也是本次鉴定的重点。在ESI模式下，鉴定出原人参三醇三萜皂苷20个，在ESI+模式下，鉴定出原人参三醇三萜皂苷1个。以化合物11与化合物23为例，解析鉴定过程。

（1）化合物11保留时间为8.96 min，准分子离子峰m/z 683.501 4[M+HCOO]，与人参皂苷对照品F1基本一致，再结合文献报道[28]可将其鉴定为人参皂苷F1。人参皂苷F1对照品与化合物11的MS/MS图见图5。

图5 ESI模式人参皂苷F1对照品与化合物11的MS/MS图Fig.5 The MS/MS spectra of ginsenoside F1 and compound 11 in the ESI mode

（2）化合物23保留时间为11.08 min，准分子离子峰m/z 637.457 3[M H]，主要产生1个碎片离子，即m/z 475.395 4[M H-Glu]，再结合文献[29]报道，鉴定为人参皂苷Rh1。化合物23的MS/MS图见图6。

图6 ESI模式人参皂苷Rh1对照品与化合物23的MS/MS图Fig.6 The MS/MS spectra of ginsenoside Rh1 and compound 23 in the ESI mode

4 讨论

近年来，心血管系统疾病发病率呈上升趋势，严重威胁着人类的健康[30]。前期研究表明[12,13]，西洋参茎叶三醇对心肌缺血再灌注及急性心肌梗死具有良好的保护作用。三萜皂苷类化合物是西洋参茎叶中主要活性成分，以往研究通过柱层析、核磁共振等方法对西洋参茎叶三醇皂苷中含量较高的成分如人参皂苷Re、Rg1和Rh1等进行了分离鉴定[16]，但对西洋参茎叶三醇皂苷的全面分析未见报道。本研究首次运用UPLCQ/TOF-MS技术结合UNIFI数据分析平台定性分析了西洋参茎叶三醇皂苷中的化学成分，从中鉴定出三萜皂苷类化合物31个，其中20位碳侧链发生变化的10个，20位碳侧链未发生变化的11个。

本研究利用飞行时间质谱高灵敏度的优势，对西洋参茎叶三醇皂苷中的微量成分，如人参皂苷F3、-Rf和伪人参皂苷RT5等也加以鉴定。研究表明，这些皂苷也具有抗炎[31]、神经保护[32]等生物活性，因此，除西洋参茎叶三醇皂苷中含量较高的成分外，这些微量成分发挥的药理作用也不容忽视。总之，本文可为西洋参茎叶三醇皂苷药物的开发和质量标准的建立提供参考。