胎儿DNA短片段富集分析法辨别无创产前检测中母体来源的假阳性病例分析

谢润桂 刘勇军 魏顺娣 何晓旋 江建荣

1.广东省东莞市妇幼保健院(523107) ；2.广东医科大学基础医学院

基于母体中胎儿游离DNA的无创产前检测(NIPT)已广泛用于临床胎儿非整倍体筛查，对13-三体、18-三体和21-三体的检测灵敏度和特异性较高[1-2]。NIPT提示非整倍体高风险或其他异常核型，但胎儿染色体是正常的称为NIPT假阳性。引起假阳性主要原因包括限制性胎盘嵌合、双胎之一凋亡、母亲染色体异常、DNA拷贝数异常、母体中胎儿DNA含量低以及母亲罹患肿瘤等因素[3]。NIPT能够准确检测母体总游离DNA的剂量变化，但无法分辨其变化来源[4]。有报道[5]在半导体测序核心算法基础上，研发了一种新的数据分析方法，以DNA片段大小来区分游离DNA剂量变化，称为胎儿DNA短片段富集法。该方法能够准确辨别母体染色体异常引起的游离DNA剂量变化，从而辨别母体来源的假阳性病例，临床取得较好效果。本研究采用胎儿DNA全片段分析法和短片段富集分析法对已证实为母体来源和胎盘来源的NPIT假阳性样本再检测分析，评价胎儿DNA短片段富集法临床应用效果。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016年10月-2017年10月本院产前诊断中心检测发现并保存的21例NIPT假阳性样本，所有病例均通过NIPT检测胎盘及母亲外周血确诊来源，其中13例为母体染色体异常(4例47，XXX、4例45,X/46,XX嵌合体和5例母体携带CNV)，8例胎盘异常来源(2例单体和6例三体)。本研究经本院伦理委员会批准，所有孕妇签署知情同意书。排除标准：①未确定母亲外周血染色体核型的病例。②胎儿游离DNA平均读长<120 bp。

1.2 检测方法

1.2.1样本采集按照检测日期和实验编号将相应的DNA样本从-80℃中取出，先行DNA浓度和纯度检测，排除不符合质量标准的样本，然后采用半导体基因测序技术进行测序。

1.2.2上机测序半导体基因测序按照晶芯胎儿染色体非整倍体T21、T18、T13检测试剂盒(CFDA注册许可证第0153400300号)说明进行文库构建和质量控制，使用Bioelectron Seq4000系统(CFDA注册许可证第20153400309号)半导体测序仪进行DNA测序。

1.2.3测序数据分析①Z值计算：测序数据分析的核心算法采用通用函数计算Z值，比对、过滤所得每个样本唯一匹配unique Reads数，并计算每个样本每条染色体unique Reads数占该样本所有常染色体unique Reads数的百分比chrN，计算待测样本染色体的Z值，Z值=(样本的%chrN-参考样本的%chrN)/参考样本%chrN的标准差。根据Z值大小判断染色体是否异常。确定染色体比例，Z值≥3为增加，<3为减少。②染色体位置-剂量分布曲线：以染色体从短臂末端至长臂末端的对应位置为横坐标，1M为单位，代表染色体的位置信息，以计算得到的Z值为纵坐标，单位为1，代表染色体的剂量信息。③胎儿DNA全片段分析法(简称M法)：测序数据经初步比对和过滤后，再通过GC校正和RUN内校正去除干扰信息后，计算得到每条染色体的Z值，在染色体位置-剂量分布曲线上用黑线表示。④胎儿DNA短片段富集分析法(简称L法)：在M法基础上，选择性分析胎儿DNA短片段富集区域(游离DNA为片段长度<130 bp)，在染色体位置-剂量分布曲线上用红线表示。

2 结果

2.1 母体来源标本检测

在母体来源的假阳性样本中，当母体染色体数目增加或存在片段重复时， Z值L法均低于M法；而当母体染色体数目减少或存在片段缺失时，L法Z值为负值，其绝对值均小于M法。在染色体位置-剂量分布曲线上L方法线比M方法更接近于基线0，见表1和图1(1080页)。

表1 母体来源假阳性样本产前诊断与两种方法检测情况

NIPT结果产前诊断 结果母亲染色体 异常染色体Z值 M方法 L方法 红线与黑线距基线0距离XO未见异常45,X4.9193.121红线更靠近基线0X染色体微缺失未见异常46,XX,del(X).[GRCH37/hg19](032.44Mb)6.2484.927红线更靠近基线0X染色体微缺失未见异常46,XX,del(Xq25q28).[GRCH37/hg19](128Mb153Mb)23.98920.413红线更靠近基线013染色体微缺失未见异常46,XX,del(13q31.1q31.3)[GRCH37/hg19](83Mb90Mb)×18.3516.341红线更靠近基线0X染色体微重复未见异常46,XX,dup(X).[GRCH37/hg19](112Mb120Mb)5.514.933红线更靠近基线021号染色体微重复未见异常46,XN,dup(21q21.2).[GRCH37/hg19](25.50Mb26.38Mb)×34.3783.211红线更靠近基线0

2.2 胎盘来源样本检测

在胎盘来源的假阳性样本中，当母体染色体数目增加或存在片段重复时，Z值L法均高于M法；而当母体染色体数目减少或存在片段缺失时，L法Z值为负值，其绝对值均高于M法。在染色体位置-剂量分布曲线上代表L法线比代表M法线更远离基线0，见表2和图2(1080页)。

表2 胎盘来源假阳性样本产前诊断与两种方法检测情况

3 讨论

NIPT的对象是源自胎儿的游离核酸[6]。孕妇从妊娠第4周开始即可检测到胎儿游离DNA，在最初3个月内胎儿游离DNA含量每周增加约21%，且血浆中胎儿游离DNA分子的长度较母源性DNA分子短很多(99%小于313bp)[7]。母体外周血的游离DNA包括来源于胎盘滋养层的胎儿游离DNA和母体白细胞产生的游离DNA，这些DNA片段的大小分布具有对应于核小体(约143bp)和染色质(核小体+连接体组蛋白约166bp)的峰值[8]。2010年，Lo等发现胎儿游离DNA的长度分布与母体细胞的游离DNA不同，母体血浆中166bp的分子比例减少，<150bp分子比例增加，可能是由于细胞凋亡过程中不同的核体包装所致，或核小体结合力的差异[9]。

由于孕妇外周血的胎儿游离DNA含量仅占血浆总游离DNA的19%，且与母体游离DNA混杂在一起，大量的母体血浆游离DNA会给胎儿游离DNA检测和分析造成干扰，因此研究者们根据胎儿游离DNA分子与母体血浆游离DNA的差异，研发了多种用于分离和富集胎儿游离DNA的方法。2017年Yang等[10]报道了一种基于PCR的选择性扩增胎儿cfDNA的方法。同年Vong等[11]报道了用单链DNA文库制备方法富集母体血浆中胎儿短cfDNA。此外，2014年Yu等[12]报道了用一种基于大小的方法取代了基于计数的方法检测常见染色三体，结果表明这种方法很有应用潜力。这些工作都集中在母体血浆中cffDNA的大小差异上，以期在NIPS中取得进展。然而，对这些方法的可行性评估仍需要足够的临床样本验证[5]。这些方法都是物理分离方法，增加了额外的实验成本。

最近，博奥木华公司研发团队在半导体测序核心算法的基础上，研发了一种非物理分离的胎儿游离DNA富集分析方法。在NIPT检测中，该方法不用增加额外的实验成本，只改变分析算法就能准确辨别母体染色体异常引起的假阳性。该方法获得测序数据后，先用通用函数核心算法计算Z值分析，根据在游离DNA片段更短的情况下，胎儿游离DNA比母体游离DNA的比例增加原理，再将母体游离DNA比例高的DNA长片段部分测序数据过滤掉，选择性分析胎儿游离DNA比例高的DNA短片段部分的测序数据，称为胎儿DNA短片段富集分析法。两种算法分别得到每条染色体相应的Z值和染色体位置-剂量分布曲线。应用L方法需要注意，该方法将长片段过滤后，测序得到的unique Reads数量会减少，可能影响结果判断。另外，一般NIPT测序的片段长度在165bp，如果DNA片段<120bp该方法失效。因为DNA小片段的比例已经很高，L方法无法再提高小片段胎儿游离DNA的浓度[5，13]。

相比于M方法，L方法分析时由于短片段DNA中胎儿游离DNA比例增加，如果胎儿游离DNA本身异常，则会将阳性信号放大，表现为Z值的绝对值增大，或者在染色体位置-剂量分布曲线上红线距离基线0更远。相反，如果胎儿游离DNA本身正常，而母体游离DNA异常，则会将阳性信号缩小，表现为Z值绝对值变小，或在染色体位置-剂量分布曲线上红线距离基线0更近。因此，根据两种分析方法Z值绝对值的变化或红黑线相对基线0的距离，准确辨别母体来源的假阳性信号，有效减少NIPT假阳性[5，14-15]。尽管胎儿DNA短片段富集分析法可以有效降低假阳性率，但有很多因素影响Z值，比如孕妇体质指数[16]及年龄、孕周、检测平台/公司等因素。所以，为了确保实验室间NIPT的信息交流和透明度，我们建议对不一致的NIPT结果进行系统记录，并通过外部质量控制和认证进行质量保证[14]。

本研究发现联合应用M方法和L方法不仅能够识别母体非整倍体异常引起的假阳性，也能够识别母体本身携带CNV引起的假阳性。通过观察染色体位置-剂量分布曲线上红黑线相对位置，判断阳性信号是否为母体染色体异常引起。DNA短片段富集分析法能够放大胎儿游离DNA的阳性信号，或者缩小母体游离DNA的阳性信号，通过阳性信号的变化准确判断阳性信号来源，从而辨别母体来源的假阳性信号；且不增加额外实验成本。在NIPT检测中胎儿DNA短片段富集分析法用于辨别母体来源的假阳性病例具有重要应用价值。