溴硝醇有关物质的测定

2021-08-10王天威钟金清刘雪婷

生物加工过程 2021年4期

向阳，王天威，钟金清，刘雪婷，胡鲲

(1. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306；2. 上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306；3. 上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306)

皮乐宝又名溴硝醇、布罗波尔，化学名为2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇，化学式见图1，它是一种白色或淡黄色无味晶体粉末。作为一种低毒、价格低廉、水溶性好、使用浓度低的广谱杀菌剂，溴硝醇在农业、医药工业、水处理和食品等领域中被广泛应用[1-3]。起初在造纸、化妆品等行业被作为防腐剂使用[4]，而后在农药方面用于水稻恶苗病[5]、猕猴桃细菌性溃疡病[6]和马铃薯黑胫病[7]等细菌性病害的防治，效果良好，且不易产生药害。近年来，溴硝醇被广泛应用于水产养殖行业以治疗水霉病[8-9]。溴硝醇可直接作用于细胞膜表面的硫醇基，使之转化为二硫化物，在细胞壁上形成一个巨大突起，导致细胞壁破裂、孢子失活[10]。González等[11]、Jantrakajorn等[12]和孙鹏等[13]研究发现，用一定浓度的溴硝醇处理克氏原螯虾、罗非鱼和虹鳟的受精卵时，可以有效提高其孵化率。

图1 溴硝醇化学式Fig.1 Chemical formula of bronopol

药物中的杂质直接影响药物的纯度，同时也与药物的质量和安全性息息相关。溴硝醇在pH升高和温度升高时，其稳定性会下降并释放甲醛[14]。此外，溴硝醇在某些条件下，会降解生成2-溴乙醇、溴代硝基甲烷等产物[15]。目前，工业上合成溴硝醇的方法主要是利用甲醛与硝基甲烷反应生成2-硝基-1, 3-丙二醇，2-硝基-1, 3-丙二醇在NaOH的作用下生成醇钠中间体，醇钠中间体再进一步与溴素反应便可得到溴硝醇，具体反应过程如图2所示[16]。根据上述合成方法，溴硝醇中可能出现的有关物质主要是2-硝基-1, 3-丙二醇。目前，国内关于溴硝醇有关物质检查分析方法的报道较少，贾凤聪[17]用薄层层析法成功分离出其主要杂质且分离度良好。本课题组的胡鲲等[18]曾建立了一种溴硝醇有关物质的高效液相色谱分析方法。除此之外，梁赤周等[19]利用高效液相色谱对20%溴硝醇可湿性粉剂进行质量检测分析，取得较好的分析效果。随着溴硝醇在水产养殖业的广泛使用，其安全性和药物残留也引起了学者的广泛关注[20-21]。本研究参照文献[18]的研究方法并稍做改良，创建了一种溴硝醇有关物质的高效液相色谱测定方法，开展了专属性、检测限、线性、精密度、再现性、稳定性、耐用性等方法学研究。

图2 溴硝醇合成路线[16]Fig.2 Synthesis route of bronopol[16]

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皮乐宝(溴硝醇)对照品，北京世纪奥科生物技术有限公司，德国Dr. Ehrenstorfer，CAS编号52-51-7(水含量0.3%，纯度98.5%)。供试品：复方皮乐宝粉，长沙拜特生物科技研究所有限公司；磷酸(分析纯)，国药集团；甲醇，德国默克公司；屈臣氏超纯水，屈臣氏。

Agilent 1100液相色谱仪和色谱柱，RP-ODS(150 mm×4.6 mm；5 μm)，德国Bio-Tek 公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：RP-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，检测波长：210 nm，流速：1.0 mL/min，流动相为磷酸水(磷酸与水的体积比为1∶1 000)和甲醇(体积比95∶5)。

1.3 溶液的配制

空白溶剂：根据制剂处方及工艺，制备空白辅料样品。

供试品溶液：在100 mL容量瓶中，放入精确称取的复方皮乐宝粉适量(约相当于皮乐宝100 mg)，加流动相稀释，摇匀；精确量取1 mL，置于100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀备用。

对照品溶液：在 100 mL容量瓶中，放入精确称取的皮乐宝对照品(约10 mg)，加流动相超声使其溶解，自然冷却至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀。精确量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀备用。

1.4 方法学考察

1.4.1 专属性试验

为考察本检测方法的专属性，对供试品进行酸破坏、碱破坏以及氧化破坏试验，各破坏条件参照本课题组的研究[18]并做了适当优化。

精密称取杂质 2-硝基-1,3-丙二醇 5 mg，加磷酸水溶解作为杂质定位溶液，以HPLC法进行测定。

酸破坏试验：精确称取溴硝醇20 mg，加入1 mol/L盐酸溶液5 mL，在90 ℃水浴的条件下加热30 min，取出冷却至室温后，用1 mol/L的NaOH调节pH，加流动相稀释制成每1 mL中含有2 mg的溶液，以HPLC法进行测定。

碱破坏试验：精确称取溴硝醇20 mg，加入1 mol/L NaOH 5 mL，在90 ℃水浴的条件下加热30 min，取出冷却至室温后，用1 mol/L的盐酸溶液中和，加流动相稀释制成每1 mL中含有2 mg的溶液，以HPLC法进行测定。

电厂锅炉在燃用无烟煤和劣质烟煤的情况下，由于经济燃烧还存在一些技术上的困难，导致煤粉不能完全燃烧，粉煤灰的含碳量一般波动于8%～20%。全国每年从电站粉煤灰中流失近千万吨的煤炭，不但煤炭资源白白流失，造成极大的资源浪费，而且因粉煤灰中含碳量的增加制约了粉煤灰后期的综合利用。

氧化破坏试验：精确称取溴硝醇20 mg，加30%过氧化氢5 mL，室温下放置1 h，取出，再加流动相稀释制成每1 mL中含2 mg的溶液，以HPLC法进行测定。另外精确称取标准品20 mg 按上述操作进行测定，作为氧化破坏对照试验。

1.4.2 溴硝醇含量线性研究及检测限、定量限研究

溴硝醇含量线性研究：取溴硝醇对照品的母液，分别吸取 40、20、10、5、2 mL置于100 mL的容量瓶中，用流动相作梯度稀释，分别制备质量浓度为200、100、50、20和0.1 μg/mL的溴硝醇对照品溶液。以HPLC法进样分析，记录色谱图。以浓度和峰面积进行线性回归，拟合曲线。

检测限与定量限研究：用信噪比法验证本方法的检测限和定量限，称取溴硝醇对照品适量，并逐级稀释至样品图谱中主峰信噪比3∶1时的浓度为检测限，信噪比10∶1时的浓度为定量限。

1.4.3 精密度与再现性研究

精密度研究：分别吸取 40、20、10、5和2 mL样品置于100 mL的容量瓶中。用流动相作梯度稀释，分别制备质量浓度为200、100、50、20和0.1 μg/mL的溴硝醇对照品溶液。

按照含量测定方法，系列梯度浓度的溴硝醇对照品溶液按照检测方法检测，日内 5次，日间5次。

再现性研究：取样品，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样 6次，进样10 μL，记录色谱图。

1.4.4 供试品溶液稳定性研究

样品制备供试品溶液，分别在1、4、6、16 h进样分析，进样10 μL，每个时间点进样2 针，记录色谱图峰面积，根据杂质含量和峰面积来考量溶液稳定性。

1.4.5 回收率研究

将对照品加入一定量的空白辅料中，按照含量测定方法进行测定。进行进样分析，记录色谱图，并计算回收率。

1.4.6 耐用性试验

为探讨供试品溶液中主成分与杂质的分离度状况，按照HPLC的色谱条件，分别通过改变柱温为20和40 ℃、改变流速为0.8和1.2 mL/min，对样品(相对于溴硝醇100 μg/mL)进行含量测定。

2 结果与讨论

2.1 专属性试验结果

利用高效液相色谱法检测得到2-硝基-1,3-丙二醇的保留时间为 4.0 min，按照面积归一法测定纯度为97.7%。空白溶剂未发现峰，说明空白溶剂无干扰。各破坏性试验部分色谱图如图3～8所示，色谱图中黑色箭头标识处即为溴硝醇的保留时间(约为 4.7 min)。图4 和图5 对比说明样品在酸破坏的条件下比较稳定，未出现降解产物。对比图6发现，样品在经碱破坏后，有降解产物形成，其中已知的有关物质为2-硝基-1,3-丙二醇在色谱图中并未出现。对比图7和图8发现，样品经氧化破坏后，仅有少量溴硝醇保留，而氧化破坏对照组的色谱图中并未出现溴硝醇，降解产物与主成分分离度良好，且主峰峰纯度均大于0.99，物料平衡在102%～106%，符合物料平衡要求(90%～110%)，说明此方法专属性较好。