大青叶水提液对金黄色葡萄球菌的体外抗菌试验

2021-08-10董刚

饲料博览 2021年6期

董刚

（西丰县郜家店动物卫生监督所，辽宁西丰 112400）

金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜共患病原菌，是导致奶牛乳房炎较高发病率的主要原因，严重威胁奶牛的健康[1]。目前，临床上防治奶牛乳房炎的主要方法仍为应用抗生素，但抗生素的使用使金黄色葡萄球菌的耐药性问题日益凸显，严重影响着人们对绿色、健康和安全奶类食品的需求[2]。应用中草药替代抗生素防治金黄色葡萄球菌造成的奶牛乳房炎是目前国内外科研学者的研究热点。大青叶为十字花科植物菘蓝的干燥叶，具有清热解毒的功效，对大肠杆菌和枯草杆菌等具有较强的抗菌活性，而有关大青叶对金黄色葡萄球菌抗菌活性的研究报道较少[3]。因此本试验探讨了大青叶对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性，以期为奶牛乳房炎的防治提供新的思路。

1 材料

1.1 试验药品

大青叶，购自安徽毫州众益堂中药材销售有限公司。

1.2 试验菌株

于2017年7月份从黑龙江省某规模化养殖场采集患奶牛乳房炎奶牛的乳汁，并从中分离出试验用金黄色葡萄球菌，制成冻干粉，备用。

1.3 培养基

胰蛋白胨大豆营养肉汤（TSB），购自青岛高科园海博生物技术有限公司；营养琼脂（NA），购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.4 主要仪器设备

400Y型多功能中药粉碎机，购自永康市铂欧五金制品有限公司；BJ-1CD型超净工作台，购自北京海天友诚科技有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，购自上海申安医疗器械厂；HN-25S型电热恒温培养箱，购自浙江力辰仪器科技有限公司。

2 方法

2.1 大青叶的预处理

应用400Y型多功能中药粉碎机将大青叶粉碎至60目后，置于封口袋中，备用。

2.2 大青叶水提液的制备

精密称取大青叶粗粉50.00 g，首次浸泡1 h，用10倍量和8倍量的超纯水分别煎煮提取1 h，然后用纱布过滤后合并滤液浓缩至500 mL，获得浓度为100 mg·mL-1的大青叶水提液；将浓度为100 mg·mL-1的大青叶水提液进行流通蒸汽灭菌1 h，然后置于4℃冰箱中保存，备用。

2.3 试验菌株的活化、纯培养和平板计数

将金黄色葡萄球菌冻干粉室温解冻后接种于TSB培养基中活化，37℃培养箱中培养18 h。用接种环在活化的菌液中蘸取，然后在NA平板上

划线，分离单个菌落，并对单一菌落进行纯培养12 h。采用平板计数法对纯培养获得的菌液进行计数。

2.4 抗菌活性测定

参照胡立磊等[4]的方法测定大青叶提取液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。取灭菌试管7支编号，于1～7管中各加入TSB 5 mL，然后于第1支试管中加入100 mg·mL-1的大青叶水提液5 mL，混匀后取出5 mL加入第2支试管中，依此类推，直到第6支试管，从管中取出5 mL弃去，使其含药浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg·mL-1；第7支试管为空白对照，只加入5 mLTSB，不加入大青叶水提液，然后1～6管中各加入5×106cfu·mL-1供试菌液0.1 mL，摇匀，置37℃培养箱中培养24 h。以不发生浑浊变化视为无细菌生长，无细菌生长的最小药物浓度为大青叶水提液MIC值。在测定的MIC值基础上将没有发生浑浊变化的试管，接种于NA平板，37℃培养箱中培养24 h，以菌落数少于5个视为无细菌生长，无细菌生长的最小药物浓度为大青叶水提液的MBC值。本试验重复3次。

3 结果与分析

测定大青叶水提物对金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值，见表1。

表1 大青叶提取液对金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值（n=3）

由表1可知，当大青叶提取液的药物浓度为3.125 mg·mL-1时，试管澄清；当大青叶提取液的药物浓度为6.25 mg·mL-1时，NA平板上无菌落生长，故大青叶水提取对金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值分别为3.125 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1。

4 讨论

本试验采用的提取方法为最传统的水煎煮法对大青叶进行煎煮。水煎煮法比较其他的方法，相对操作简单、易于操作，适合兽医临床的应用，且研究的成本相对较低、更易于获得结果[5]。同类型的试验采用的方法还有醇提法和超滤提取法等，但研究方法操作较为繁琐、研究成本相对较高，因此本研究采取了传统的水煎法获取大青叶水煎液。

大青叶具有清热解毒、凉血消斑等多种功效，其主要具有抗病原微生物、提高机体免疫力等多种药理作用[6]。在兽医临床上，大青叶可应用于奶牛乳房炎。奶牛乳房炎主要是金黄色葡萄球菌的引起的奶牛疾病，奶牛发生乳房炎的初期主要出现体温升高和乳房部炎症，此时解表、消炎尤为重要。现代兽医药理学研究表明，大青叶中含有的多种药用成分，如生物碱、有机酸和多糖等，且这些物质均对金黄色葡萄球菌等细菌具有一定的抗菌活性[8]。本试验结果显示大青叶水提液对金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值分别为3.125、6.25 mg·mL-1，这充分证实了大青叶对金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌活性。