猪细小病毒病灭活疫苗灭活工艺研究

陈丕坤，李 倩

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

猪细小病毒（PPV）主要引起母猪产畸形胎、死胎、木乃伊胎以及流产、不孕、不发情等繁殖障碍病[1]，大多是通过母猪与仔猪之间的胎盘垂直传播，也经常由配种公猪通过其精液传染给易感母猪。PPV感染普遍存在于世界各地的猪群中，发病没有明显的季节性，但由于猪群的交配和母猪的生产通常在春季和秋季进行，故春秋季节猪细小病毒病的发病率相对较高[2]。为了给猪细小病毒病的防控提供安全可靠的灭活疫苗，本试验探讨了灭活剂二乙烯亚胺（BEI）对猪细小病毒的灭活条件，从而为制备猪细小病毒灭活疫苗提供试验参考。

1 材料

1.1 细胞

ST细胞工作细胞库，由哈药集团生物疫苗有限公司保存和提供。

1.2 病毒液

猪细小病毒L株病毒液，豚鼠红细胞凝集价为1∶512，病毒含量为107.36TCID50·mL-1，由哈药集团生物疫苗有限公司制备、保存和提供。

1.3 主要试剂

2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）购自Sigma公司；DMEM培养基、新生牛血清、0.25%胰酶购自Gibco公司。

2 方法

2.1 BEA的环化

将BEA按2%的量加至0.2 mol·L-1的氢氧化钠溶液中，置37℃水浴，每10～15 min振摇1次，作用1 h，即环化为二乙烯亚胺（BEI），无菌过滤。

2.2 猪细小病毒L株病毒液的灭活工艺研究

取猪细小病毒L株病毒液，分别按照975、990 mL·瓶-1和995 mL·瓶-13个规格定量分装到5 L的三角瓶内，然后按分装规格的不同将病毒液分成3组。加入2%的BEI溶液至1 000 mL，使第1组BEI的终浓度为0.05%，第2组BEI的终浓度为0.02%，第3组BEI的终浓度为0.01%，边摇边加，摇匀后倒瓶。将加入BEI后的病毒液置30℃下进行灭活。每隔4～6 h摇匀1次，待病毒液温度达到规定的温度时开始计时，分别于灭活后24、36、48、60、72、84 h用终浓度为2%的硫代硫酸钠溶液终止灭活，并分别从每瓶中抽取5 mL进行灭活效果检验。

2.3 红细胞凝集价测定

按现行《中国兽药典》附录进行测定。

2.4 灭活检验

取1 mL灭活的猪细小病毒L株病毒液，接种到新消化的ST细胞培养瓶中（75 cm2），置37℃下培养72 h，接种细胞盲传2代，观察细胞病变情况并对收获的这三代细胞液进行红细胞凝集价检测。

2.5 灭活验证

取猪细小病毒L株病毒液980 mL，按照在灭活工艺研究中确定的灭活参数进行3次灭活验证。

3 结果与分析

3.1 猪细小病毒L株病毒液的灭活工艺研究结果

对猪细小病毒L株病毒液用不同终浓度的BEI溶液、不同灭活时间进行灭活参数确定。BEI溶液终浓度为0.01%时不同时间取样接种细胞，均出现细胞圆缩、皱缩等不同程度的细胞病变，个别能检测出血凝效价，结果详见表1。

表1 不同终浓度BEI溶液对猪细小病毒L株病毒液的灭活效果

续表

BEI溶液终浓度分别为0.02%和0.05%，灭活60 h以上可以使病毒液灭活完全。为保证大规模生产中病毒的灭活效果和疫苗使用过程的安全性，确定使用终浓度为0.02%的BEI溶液、在30℃条件下灭活72 h作为猪细小病毒L株病毒液的灭活工艺。

3.2 灭活验证结果

灭活验证结果见表2。

表2 猪细小病毒L株病毒液灭活验证结果

对猪细小病毒L株病毒液按照终浓度为0.02%的BEI溶液、在30℃条件下灭活后72 h，用终浓度为2%的硫代硫酸钠溶液终止灭活，并进行3次灭活验证，结果显示所有组别均灭活彻底。

4 结论

通过对猪细小病毒L株病毒液灭活工艺中BEI的终浓度和灭活时间比较，以及根据所确定的灭活工艺对病毒液进行灭活验证，确定用终浓度0.02%的BEI溶液，在30℃条件下灭活72 h，用终浓度为2%的硫代硫酸钠溶液终止灭活，作为猪细小病毒病灭活疫苗的灭活工艺。