骨保护素(OPG)基因多态性与种植体周围组织疾病的相关性研究

姚舜 刘倩 邓巍

种植体周围组织疾病(peri-implant disease)是指发生在种植体周围软硬组织之间的一种病理状态，包括仅累计种植体周围软组织的可逆的种植体周围黏膜炎,以及可造成骨吸收的不可逆的种植体周围炎，已成为现阶段影响种植远期成功最重要的因素之一[1]。时至今日，种植体周围组织疾病其病因和发病机制尚未被完全揭示，除菌斑微生物、负载过重、口腔卫生习惯等[2-4]，近期研究表明，基因的多态性也是引起种植体周围组织疾病的一大因素[5]。

骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是于1997 年被发现的一种可溶性分泌型糖蛋白，相关研究已经证实其为骨代谢中的一个重要调控因子，可以通过抑制破骨细胞分化、活化、成熟等方式减缓骨吸收增加骨密度。目前，OPG与口腔疾病的相关性已被广泛研究[6-8]，但尚未见到关于OPG-A163G位点多态性与种植体周围组织疾病相关性的报道。本研究旨在探讨OPG-A163G位点的基因多态性与种植体周围组织疾病易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年 10 月～2020 年3 月于中国医科大学人民医院口腔科就诊的种植体周围组织疾病患者与健康种植体患者各80 例，分为种植体周围组织疾病组和健康种植体组，种植体周围组织疾病组中又进一步细分为种植体周围炎组(53例)和种植体周围黏膜炎组(27 例)。病例纳入标准:(1)患者已签署知情同意书；(2)口内存在至少1 枚OSSTEM TSIII SA型种植体；(3)上部修复已满至少1 年，均为单冠。病例排除标准：(1)存在影响骨代谢或愈合能力的全身疾病者；(2)近期接受过免疫抑制药物治疗或放射剂量超过60 Gy的头颈部放疗的患者；(3)近期使用过二磷酸盐的患者；(4)3 个月内使用非甾体类抗炎药、肾上腺皮质激素等的患者；(5)存在口腔内其他感染灶、颌骨囊肿等局部病变的患者；(6)存在不良口腔习惯的患者；(7)正在妊娠或哺乳的妇女；(8)设计不合理等医源性因素所致者。

种植体周围组织疾病的诊断遵循2017 年世界牙周和种植体周围组织疾病分类研讨会第四工作组共识报告所公布的种植体周围组织疾病诊断标准[11]。健康种植体诊断标准：(1)无软组织黏膜红肿；(2)无探诊出血;(3)无溢浓；(4)无探诊深度增加；(5)骨改建后无牙槽脊顶水平的骨吸收。种植体周围黏膜炎诊断标准：(1)骨改建后无牙槽脊顶水平的骨吸收；(2)存在溢浓或探诊出血。种植体周围炎诊断标准：(1)存在溢浓或探诊出血；(2)与基线相比探诊深度增加；(3)骨改建后存在牙槽脊顶水平的骨吸收。若缺少基线数据，则通过以下标准进行诊断：(1)探诊深度≥6 mm；(2)溢浓或探诊出血；(3)种植体周骨嵴顶距离种植体骨内最冠方处≥3 mm。

义齿修复完成的同时采集所有患者的临床信息并以平行投照法获取种植体的X线片以作基线资料。同时记录所有患者基本病例资料。经检验，两组间基本病例资料均无统计学差异(P>0.05)(表 1)。

表 1 两组患者基本病例资料

1.2 主要仪器及试剂

PCR扩增仪、凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；恒温震荡水浴(WSY-065，无锡石仪)；低温高速离心机(Thremo Scientific Heraeus Multifuge，德国)；水平电泳系统(北京六一仪器厂)；Taq Master Mix酶、DL2000 DNA Maker(大连宝生物工程有限公司)；引物、柱式口腔拭子基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)；Loading Buffer(赛默飞世尔，美国)等。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA模板的制备 使用柱式口腔拭子基因组DNA抽提试剂盒在患者颊黏膜脱落的上皮细胞中提取目的DNA。

1.3.2 PCR扩增 引物的合成与设计：正向引物序列为5'-CTGGAGACATATAACTTGAACA-3',反向引物序列为5'-CCATCATCAAAAGGCCTATTGGT-3'。PCR反应体积：ddH2O 17 μL、Taq Master Mix酶25 μL、正向引物1.5 μL、反向引物1.5 μL、DNA模版5 μL，总体积50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重复32 个循环，最后72 ℃终末延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳：使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物是否为特异性扩增产物，并于凝胶成像系统下观察并拍摄照片。

1.3.3 Sanger基因测序 将160 例合格的PCR产物进行Sanger基因测序，结果使用Chromas软件分析。

1.4 统计学分析

研究对象进行哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg，H-W)平衡定律检验，P>0.05则符合H-W平衡。应用SPSS 23.0分析实验数据，采用χ2检验比较3 种基因型及等位基因分布频率在不同组别中的差异;疾病相关风险用比值比(odds ratio,OR)及95%可信区间(confidence interval,CI)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR-Sanger测序结果

琼脂糖凝胶电泳结果显示，经PCR扩增后的产物长度为300 bp(图 1)；将160 例合格的PCR产物进行Sanger测序后，峰图中OPG-A163G位点共出现3 种基因型，即A/A、G/G和G/A(图 2)。

图 1 PCR扩增电泳图

图 2 Sanger基因测序图

2.2 OPG-A163G基因型和等位基因的分布频率

经检验，所选样本符合H-W定律(P=0.07)，具有群体代表性。种植体周围组织疾病组OPG-A163G基因型频率分别为GG 12.50%、GA 37.50%、AA 50.00%，等位基因G频率分布为31.25%，等位基因A频率分布为68.75%；健康种植体组3 种基因型频率分布分别为GG2.50%、GA22.50%、AA75.00%，等位基因G频率分布为13.75%，等位基因A频率分布为86.25%。两组之间的比较存在统计学差异(基因型χ2=12.33，P=0.00;等位基因χ2=14.05，P=0.00)；其中，GG基因型的OR值为5.57(95%CI为1.18～26.31)，GA基因型的OR值为2.07(95%CI为1.03～4.13)，G等位基因的OR值为2.85(95%CI为1.63～4.99)，A等位基因的OR值为0.35(95%CI为0.20～0.61)(表 2)。种植体周围炎组OPG-3102735 3 种基因型频率分布分别为GG17.00%、GA39.62%、AA43.40%，等位基因G频率分布为36.79%，等位基因A频率分布为63.21%。经检验，种植体周围炎组与健康种植体组之间的比较同样存在统计学差异(基因型χ2=16.10，P=0.00;等位基因χ2=19.16，P=0.00)。其中，GG基因型的OR值为7.98(95%CI为1.65～38.58)，GA基因型的OR值为2.26(95%CI为1.06～4.84)；G等位基因的OR值为3.65(95%CI为2.01～6.64)，A等位基因的OR值为0.27(95%CI为0.15～0.50)(表 3)。进一步分析得知，种植体周围黏膜炎组与健康种植体组之间不存在OPG-A163G基因多态性的差异(基因型χ2=1.85,P=0.37;等位基因χ2=1.36,P=0.24)(表 4)。

表 2 OPG-A163G基因多态性与种植体周围组织疾病的关系 [n(%)]

表 3 OPG-A163G基因多态性与种植体周围炎的关系 [n(%)]

表 4 OPG-A163G基因多态性与种植体周围黏膜炎的关系 [n(%)]

3 讨 论

近年来有研究提示，牙槽骨的骨改建可能与OPG-RANKL-RANK骨调节机制有关[10]。RANK为细胞核因子-κB受体活化因子，而RANKL为细胞核因子-κB受体活化因子配体，RANK与RANKL特异性结合后引起的级联扩增反应可促使破骨细胞分化。而OPG可视为RANKL的诱骗受体，其通过与RANK竞争性地结合RANKL来阻断破骨细胞分化的RANK/RANKL信号传导途径，从而抑制破骨细胞分化。此外，OPG还可直接减少破骨细胞的数量从而达到抑制其溶骨作用的目的[11]。鉴于OPG在骨代谢中所发挥的重要作用，其与种植体周围组织疾病之间的关系也日益被重视。某些体外及动物实验表明，OPG是调节慢性牙周炎患者牙槽骨吸收的重要因子[12]。Liu等[13]在实验时发现OPG可以显著增强种植体周围的骨结合，并且可以有效改善骨小梁的显微结构。Kapasa等[14]认为，增加种植体周围OPG表达可减小种植手术的失败率并有效控制种植术后并发症的发生。

本研究选取的rs3102735位点位于OPG基因的启动子区域。结果显示，种植体周围组织疾病组与健康种植体组研究对象OPG-A163G位点的基因型和等位基因分布存在统计学差异，表明种植体周围组织疾病患者与健康种植体患者之间存在OPG-A163G位点多态性的差异，其中GG和GA基因型的OR值分别为5.57和2.07，表明GG和GA基因型的个体可能更易罹患种植体周围组织疾病，G等位基因的OR值为2.85，表明G等位基因可能是种植体周围组织疾病易感的危险因素之一，且携带至少一个G等位基因的个体患种植体周围组织疾病的概率是未携带G等位基因个体患病率的2.85 倍，A等位基因的OR值为0.35，表明A等位基因可能是种植体周围组织疾病的保护因素之一。在这一基础上深化分析可得知，种植体周围炎组与健康种植体组3种基因型及等位基因分布频率的差异同样有统计学意义(P<0.05)。其中GG基因型的OR值为7.98，GA基因型的OR值为2.26，表明基因型为GG和GA的个体可能更易患种植体周围炎，G等位基因的OR值为3.65，表明G等位基因可能是种植体周围炎易感的危险因素，且携带至少一个G等位基因的个体患种植体周围炎的概率是未携带G等位基因个体的3.65 倍，A等位基因的OR值为0.27，表明A等位基因可能是种植体周围炎的保护因素。种植体周围黏膜炎组与健康种植体组患者之间不存在OPG-A163G基因多态性的差异(P=0.37)，表明OPG-3102735基因多态性与种植体周围黏膜炎无明显相关性，或仅通过与其他基因的协同作用而致病。在此领域，Zhou等[15]也进行了相关的探索，其在研究OPG-T950C和OPG-G1181C位点基因多态性与种植体周围炎易感性之间的关系时发现，OPG-1181G/C位点的多态性可能与种植体周围炎的发病风险相关，且CC基因型携带者比GG基因型携带者更易患种植体周围炎(P=0.04，OR=2.18)。此外，携带C等位基因的患者患种植体周围炎的风险是未携带C等位基因患者的1.47 倍(P=0.04，OR=1.47，95%CI=1.01～2.13)，而OPG-950T/C位点的病例组与对照组之间基因型及等位基因的分布频率无显著差异(P>0.05)，同时在研究中共发现了G-T、C-C、G-C和C-T 4 种单体型，其中G-C单体型可能与种植体周围炎易感性的增加有关。这与Kadkhodazadeh等[16]的研究结果相一致。

本研究结果提示，OPG-A163G基因位点的多态性很可能是种植体周围组织疾病发生的一个重要危险因素，结合高娟娟等[17]的研究，为进一步揭示种植体周围组织疾病的发病机制及早期预防和治疗等提供了一定的理论参考依据。考虑到本实验的研究对象主要局限在中国东北地区人群中，故选择性效应难以完全避免，且存在样本量较小等问题，这些都可能对研究结果产生一定程度上的影响，故后续尚需进行大样本、多种族、多基因的研究。此外，OPG基因启动子和内含子中的其他多态性位点也应被更多的纳入分析之中，以分析其不同位点之间的连锁效应。