浙江近年育成粳稻新品种(系)部分抗病虫基因的分子检测与育种应用

黄 宣， 金林灿， 叶朝辉， 姜洁锋， 施贤波

(宁波市农业科学研究院 作物研究所，浙江 宁波 315040)

水稻(Oryzasativa)作为全球最重要的粮食作物之一， 养育着全世界半数以上的人口，我国是世界上最大的稻米生产国和消费国之一[1]。即使在越来越科学的管理下，水稻在大田生产过程中仍避免不了病虫害的威胁[2]。稻瘟病[3]、白叶枯病[4]、褐飞虱[5]是水稻生产上主要病虫害， 会对水稻产量和品质产生重要的影响。农药防治成本较高并且容易污染环境，选用聚合不同抗性基因的多抗品种是保障水稻绿色生产的重要途径。因此，针对这些病害的抗性基因定位和克隆工作一直备受关注。近年来，研究人员就水稻稻瘟病、白叶枯病、褐稻虱抗性基因进行了较为深入的系统研究。利用分子标记手段定位到100多个稻瘟病主效抗性基因，已克隆36个[6]；利用形态标记和分子标记定位抗白叶枯病基因40 个，已被定位的抗性基因有 32 个，其中被克隆的基因有 9个[4]；目前国际上已确认并在期刊上报道的水稻抗褐飞虱基因有43个，其中38个已被定位[7]，Bph3 (Bph17)、Bph14、Bph26 (Bph2) 和Bph29 已经被克隆[5]。基于以上抗性基因序列，人们开发了一系列特异性分子标记[8-10]，利用分子标记辅助选择技术快速、准确、系统地从大量水稻材料中鉴定抗病虫基因，为抗病虫水稻新品种培育带来了新契机，提高了育种效率。

水稻是浙江省的主要粮食作物，在粮食生产中具有举足轻重的地位[11]。浙江省水稻种植基本呈“南籼北粳”的特点，籼稻推广面积占水稻生产面积的 44.0%左右，粳稻占 56.0%左右，近年来，粳稻面积有增加的趋势[12]。浙江省在水稻生长季节高温多雨，台风多，稻瘟病、白叶枯病、褐飞虱等病虫害高发。目前，普遍认为培育抗病虫水稻新品种是提高品种抗性最经济有效的措施[13]。明确近年来育成的常规晚粳稻品种(系)的抗病虫基因组成是基于分子标记辅助选择技术改良品种抗性的重要前提。何海燕等[14]对40份浙江省水稻主栽品种中5个稻瘟病抗性基因进行了分子检测，初步明确了这些稻瘟病抗性基因的分布情况。兰波等[15]利用特异性分子标记技术对44份江西早籼杂交稻的9个抗稻瘟病基因进行检测，初步明确了抗性基因在江西稻区早籼杂交稻的分布。本研究以Pigm、Pi2、Pita等十一个抗稻瘟病基因，Xa21、Xa23两个抗白叶枯病基因，及Bph14、Bph15两个抗褐飞虱基因为研究对象，应用特异性功能标记对浙江省近年其新育成的61份常规晚粳品种(系)中的抗病虫基因进行分子检测，分析其在水稻中的分布和应用情况，并利用部分抗性基因来改良本地品种的抗病虫性，验证其抗性，以期为通过分子聚合育种技术选育多抗水稻新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试61份常规晚粳稻品种(系)为浙江省内7家育种单位近年来(2008—2019年)育成或生产中推广的14个品种，以及参加联合品比试验或区试的47份优秀品系(表1)。所有材料于2020年种植在宁波市农业科学研究院水稻育种基地内。

表1 供试品种(系)名称及来源

1.2 DNA提取与检测

每个品种采集1个单株的2 cm长叶片，放置离心管中并加入2～3颗钢珠，加入CTAB抽提液在净信Tissuelyser-II组织研磨仪上对样品叶片进行研磨，按步骤提取DNA，采用1.5%琼脂糖电泳检测DNA质量，加入适量无菌水(ddH2O)溶解后置于-20 ℃冰箱中备用。

1.3 PCR扩增

检测采用PCR扩增方法。本研究所用抗稻瘟病、抗白叶枯病、抗褐飞虱PCR特异性引物信息见表2，委托上海英骏生物技术有限公司合成引物。10 μL的PCR反应体系包含DNA模板1 μL、10 μmol·L-1正反向引物各1 μL、2×Easytaq PCR SuPerMix 3 μL，ddH2O 4 μL。在PCR仪上进行扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性45 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30～35个循环；最后72 ℃延伸8 min。

表2 用于PCR反应的引物名称、序列及预期片段长度

1.4 产物检测

抗病基因的扩增产物用添加GelStain核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统进行观察和拍照。

2 结果与分析

2.1 分子标记检测结果

利用15个抗病虫功能标记对供试的61份粳稻品种(系)进行检测，结果显示，所有材料均未扩增出抗稻瘟病基因Pi1和抗白叶枯基因Xa21和Xa23的抗病条带，剩余的12个抗病虫基因则在61个材料中有不同程度的分布(图1、图2)：其中Pigm基因检出率最低为1.64%，只在来源于浙江农业科学院的品系R1825中检出；Pb1、Bph14、Bph15三个抗性检出率较低，分布频率分别为6.56%、6.56%、11.48%；Pish/Pi54、Pi9、Pi5、Pit检出频率分别为24.59%、26.23%、32.79%、34.43%；分布频率在65%左右的基因有3个，分别为Pita、Pi2、Pikm；检出率最高的抗性基因Pib，达到91.80%，即61份材料中有56份材料中含有Pib。浙江新育成61份粳稻中品种(系)中稻瘟病分布频率从高到低分别为Pib>Pikm>Pi2>Pita>Pit>Pi5>Pi9>Pish/Pi54>Pb1>Pigm>Pi1(图3)。

图1 十五个抗性基因在61个常规晚粳稻品种(系)中的分布

M，DL2000；Pigm对照为谷梅四号；Bph14、Bph15对照为B5。琼脂糖电泳泳道1～30 ： 宁88、宁84、宁81、宁39、丙17-02、绍粳19-34、HZ16-78、丙19-26、R9079、丙19-339、春江190、ZH19-02、浙糯106、绍糯9714、ZH19-12、浙粳96、R1825、丙16-135、ZH16-98、甬粳19-46、春江糯8号、HZ-1137c、嘉禾628、R182、嘉16-48、春江糯7号、绍粳18、嘉124、甬粳18-60和秀水134。

就品种(系)而言，61份供试材料均有抗性基因检出，检出数量在2～8个。其中甬粳19-46、台19-84、绍粳19-34、嘉60四份材料只携带两个抗性基因，中嘉8号、宁84、宁88等33份材料有3～4个抗性基因被检出，携带5～6个抗性基因的材料有20份，携带7～8个抗性基因的材料有4份，分别为丙17-204、丙17-02、丙16-135、丙16-111(表4)。以上结果表明，浙江粳稻品种(系)在携带的已知抗稻瘟病基因上存在明显差异，Pikm、Pita、Pi2和Pib总体应用较广，其中Pib的应用最广。抗褐飞虱基因Bph14、Bph15在61份材料中检出率较低，只在嘉兴农科院“丙”系列材料中和中国水稻研究所“春江”系列中有检出，而同时检出Bph14、Bph15基因的材料有4份，分别为丙19-26、丙17-02、丙16-135、丙16-111。

表4 六十一个水稻品种(系)抗性基因分子标记检测

2.2 部分抗病虫基因的育种利用

由于在供试材料中未检测到携带Xa23基因的品种(系)，本研究利用含有Xa23基因的籼稻品系R416和中感白叶枯病的粳稻品种宁84杂交，以宁84为轮回亲本，通过分子标记辅助选择将Xa23导入宁84背景中，在BC1F1代利用剪叶法进行白叶枯病接种，混合菌液由浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所提供，对含有Xa23的单株抗病效果进行了初步评价。结果显示，含有Xa23基因的单株均表现为高抗，未检出的为中感(图3)，初步表明，Xa23可以增强粳稻对白叶枯病的抗性。

M，DL2 000；Xa23的对照为R416。

为验证抗褐飞虱基因Bph14、Bph15的在粳稻中的抗性，本研究利用含有抗褐飞虱基因Bph14、Bph15的种质丙16-111和不含抗褐飞虱基因的晚粳品种宁84、宁88杂交，杂交分离后代通过分子标记辅助选择含有Bph14、Bph15基因且农艺性状优良的单株，在F5代对基本稳定的品系委托武汉大学何光存实验室进行褐飞虱抗性鉴定，鉴定方法采用标准苗期集团法，每份材料重复3次。当感虫材料TN1死苗率达到95%左右时，按照国际水稻所的标准对每个重复的待鉴定水稻材料分别进行读数，最后计算平均值。结果表明，不含有Bph14、Bph15基因的品种宁84、宁88抗性结果为感虫，导入Bph14、Bph15的品系均达到抗以上级别(表3)，结果表明，聚合了2个抗虫基因的水稻品系，相对于只有1个抗虫基因的水稻品系来说，对害虫具有更强的趋避性和抗生性(图4)。

图4 水稻材料对褐飞虱的抗性表现

3 结论与讨论

稻瘟病、白叶枯病、褐飞虱是水稻三大病虫害，浙江省品种审定委员会将稻瘟病、白叶枯病、褐飞虱抗性作为水稻品种审定的主要衡量指标。因此，水稻抗病基因的定位克隆和分子机理研究一直是生物学家和育种家关注的焦点。随着越来越多抗稻瘟病基因的定位、克隆，一大批基因特异性分子标记被成功开发，如Pita、Pib、Pit、Pb1等[16-18， 23-24]，为抗病育种带来了新的契机。

本研究利用15个抗病虫功能标记对61份浙江新育种的粳稻品种(系)进行分子检测，结果表明,浙江新育成品种(系)中未检测到抗稻瘟病基因Pi1，其他抗稻瘟病基因都有不同程度的分布。Pi2、Pi9、Pigm等是位于第 6 染色体短臂靠着丝粒附近的一个抗性基因簇，它们虽然存在一定的抗谱差异，但对不同地区来源的绝大多数稻瘟病菌都具有良好的抗性[29]。何海燕等[22]2019年研究表明，Pi2、Pi9对浙江省稻瘟病生理小种的抗性频率分别为58.87%和60.99%，具有较广的抗谱，本研究表明，浙江新育种粳稻品(系)中Pi2基因的分布频率为67.21%，Pi9基因的分布频率为26.23%，说明Pi2基因在浙江粳稻中得到了较广泛的应用，Pi9基因的利用应该加强。Pigm是从四川籼稻“谷梅4号”中分离鉴定的一个广谱持久抗性基因，有研究表明，Pigm基因对稻瘟病生理小种的抗性频率高达91.9%，抗谱较等位基因Pi2、Pi9等更广，达75%左右，且在粳稻中几乎不存在该基因[30-31]，本研究中Pigm分布频率仅为1.64%，61份品系中只有1份品系被检测到Pigm基因，说明Pigm基因在浙江粳稻中初步得到应用，未来应进一步加强其在粳稻育种中的应用研究。Pib和Pita是最早克隆的两个具有广谱抗性的稻瘟病基因，它们普遍存在于中国现有粳稻栽培品种中，据陈涛等[31]研究，在江苏粳稻中Pita、Pib的分布频率分别为45.8%、 64.6%，且Pita、Pib组合表现出良好的抗性，而本研究中Pita和Pib的分布频率为63.93%、91.80%，说明这两个基因在浙江粳稻中比江苏粳稻得到更广泛的利用。另外Pik位点的Pikh/Pi54、Pikm都在浙江粳稻中有一定的分布。本研究中浙江新育成粳稻品种(系)均携带多个抗稻瘟病基因，最少的2个，最多的有6个，据相关研究证明携带抗病基因并不代表表型抗病[15， 32]，抗性水平既与抗性基因数量的累加有关，亦与抗性基因之间的互作有关。掌握水稻品种的抗稻瘟病基因型是改善水稻抗稻瘟病育种工作合理布局的基础，也是改良优质水稻抗性资源和培育抗病新种质的有效途径。

续表4 Continued Table 4

水稻白叶枯病是水稻最严重的病害之一，是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种侵染引起的细菌性病害。Xa21为成株期广谱高抗白叶枯病基因[33]，Xa23基因则表现高抗、完全显性和全生育期抗性[28]。本研究中在浙江新育成的61个粳稻新品种(系)中均未检测到这2个基因，表明在浙江粳稻种中还没用到这2个基因资源，浙江粳稻中的抗白叶枯病基因型有待进一步明确。王付华等[34]研究表明，在20个沿黄粳稻中也未检测到Xa21，而Xa23的分布频率是60%。本研究中利用籼稻中的Xa23导入粳稻宁84中，在BC1F1中利用剪叶法接种发现Xa23能显著的增强粳稻的抗性。因此，在未来的育种工作中，要针对性开展Xa23 和Xa21抗性基因水稻资源的引进与利用，进一步提高浙江粳稻对白叶枯病的抗性。

褐飞虱，属同翅目飞虱科，能远距离迁飞，是中国和许多亚洲国家当前水稻首要害虫。本研究中利用抗褐飞虱Bph14、Bph15功能标记对浙江61水稻新品种(系)进行检测，结果显示，同时检出Bph14、Bph15基因的材料有4份，均来源于嘉兴市农业科学研究院，说明嘉兴农业科学研究院在育种中重视对褐飞虱抗性基因的利用，为今后粳稻抗褐飞虱育种提供了良好的抗源。蔡之军等[35]研究利用分子标记技术将B5 中抗褐飞虱基因Bph14、Bph15导入浙北当家栽培粳稻品种秀水134、嘉58中，结果表明B5 携带的抗性基因在粳稻背景中能够有效表达，能够增强褐飞虱抗性。本研究利用含有Bph14、Bph15基因的丙16-111与宁88、宁88杂交，通过分子标记辅助选择在F5代对含有Bph14、Bph15的单株进行抗性鉴定，结果表明，导入Bph14、Bph15的株系均达到抗以上级别。本研究结果与蔡之军等[35]的研究结果相同，说明Bph14、Bph15在浙江粳稻育种中具有较高的利用价值。

本研究结果表明，浙江省新育成的常规晚粳稻品种(系)具有多个抗稻瘟病基因，未检测到Pil基因，部分品系中含有抗褐飞虱基因Bph14、Bph15，未检测到抗白叶枯基因Xa21、Xa23，可能从一定程度上反映出浙江新育成水稻品种(系)部分抗虫害抗性基因的分布情况。抗白叶枯基因Xa23、抗褐飞虱基因Bph14、Bph15在粳稻育种应用表明以上3个基因均具有良好的应用前景，其他抗病基因的实际抗性效果还需要通过田间检测进行验证。本研究结果为今后利用分子标记辅助技术将多个目标抗性基因转移到这些待改良品种中，从而培育广谱多抗水稻新品种提供了科学依据。