荣筋拈痛方含药血清对骨关节炎大鼠SDF-1／CXCR4信号通路的影响

陈 俊，郑若曦，张 婷，戴雨婷，叶锦霞，3，吴广文，3*

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是中老年人群中常见的一种关节疾患，发病部位可位于膝关节等全身多处关节，常表现为关节疼痛、肿胀和活动受限，严重者可致畸致残，对患者日常的工作生活带来极大困扰［1］。相关研究发现，OA与炎症和内质网应激有关［2-3］。因此，调控炎症环境和应激是治疗OA的有效途径，而基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived faceor-1，SDF-1）与趋化因子CXC基序受体4（chemokine C-X-C motif receptor 4，CXCR4）信号通路在炎症反应方面具有重要作用［4］。荣筋拈痛方源于国医大师陈可冀院士《清宫配方集成》［5］中治疗骨痹的高频、核心用药组方，包括牛膝、当归、独活等六味药，具有补肝肾、壮筋骨、祛风湿、止痹痛的功效［6］。前期研究发现，荣筋拈痛方可有效改善膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）患者的临床症状［7］，延 缓 软 骨 退 变［8-9］，但 是 否 通 过 调 节SDF-1／CXCR4信号通路发挥作用，尚不明确。本研究以SD大鼠OA滑膜细胞和退变软骨细胞为研究对象，观察荣筋拈痛方含药血清对SDF-1／CXCR4信号通路相关调节因子的影响，探讨荣筋拈痛方治疗OA的作用机制，为其临床应用提供依据。

1 实验材料

1.1 实验动物2月龄SPF级SD大鼠45只和4周龄SPF级SD大鼠6只均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2019-0007。

1.2 实验药物 荣筋拈痛方包括牛膝、当归、独活等六味药，购于闽侯县上街致诚医药商店。制备方法：按固液比1∶10加入蒸馏水进行回流提取，提取3次，每次1.5 h，离心去除药渣后合并滤液，旋转蒸发浓缩至一定生药量后置于4℃存储备用。

1.3 实验试剂SDF-1 ELISA检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）；SDF-1、CXCR4、基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-3、MMP-9、MMP-13一抗（美国Abcam公司）；二抗（美国Millipore公司）；SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13引物（福州尚亚生物技术有限公司）。

1.4 实验仪器 酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司）；ABI实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；蛋白核酸分析仪（美国Beckman Coulter公司）。

2 实验方法

2.1 含药血清制备 健康2月龄SPF级SD大鼠36只，雌雄各半。按1∶2的比例随机分为空白血清组12只与含药血清组24只，动物给药剂量根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算［10］，含药血清组大鼠按4.5 g／（kg·d）予荣筋拈痛方药液灌胃，分上午、下午2次灌胃；空白血清组于同等条件下灌服等体积的生理盐水。连续灌胃7 d，采血前禁食12 h，分别在末次灌胃2 h后，于10%水合氯醛麻醉下腹主动脉采血，4℃冰箱过夜，3 000 r／min离心15 min，分离血清，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存备用。

2.2 滑膜细胞获取 参照文献［11］完整剥离滑膜组织，简要步骤如下：2月龄SD大鼠脱臼处死后，膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出髌骨，继续向下分离，可见平滑光亮滑膜组织，剪刀分离滑膜层和纤维层，取出滑膜层组织。将获取的滑膜组织放于装有含双抗的生理盐水中，备用，之后采用Ⅱ型胶原酶消化法获取滑膜细胞［12］。

2.3 分组与干预 采用4%木瓜蛋白酶注射关节腔的方法建立KOA模型大鼠，空白组为正常大鼠膝关节滑膜细胞，模型组和治疗组为KOA模型大鼠膝关节滑膜细胞。空白组与模型组细胞用体积分数10%空白血清培养，治疗组用体积分数10%含药血清培养，干预24 h后检测相关指标。

2.4 退变软骨细胞模型 参照课题组前期取材方法，无菌条件下游离并截取4周龄SD膝关节，置入无菌培养皿，带入超净工作台操作。先用PBS充分漂洗，刮除关节周围附着的肌肉、脂肪等组织后用PBS充分漂洗。用刀片削取每个关节表面的软骨，PBS充分漂洗软骨小块3次，采用酶消化法，消化、获取正常软骨细胞［13］，培养、传代至第三代，再予10 ng／mL的IL-1β诱导24 h，获得退变软骨细胞［14］。

2.5 干预 建立退变软骨细胞模型后，分别更换空白和含药血清干预后的滑膜细胞上清液，即空白组，用10%空白血清干预后的空白组滑膜细胞上清液培养；模型组，用含10%空白血清干预后的模型组滑膜细胞上清液培养；治疗组，用含10%含药血清干预后的治疗组滑膜细胞上清液培养；培养24 h后检测相关指标。

2.6 ELISA法检测滑膜细胞上清液SDF-1含量

收取各组滑膜细胞上清液，参照试剂盒说明书测定各组样本SDF-1含量。

2.7 Real-time PCR法检测滑膜细胞SDF-1和退变软骨细胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表达 收集各组细胞，TRIzol法提取总RNA，核酸分析仪检测各样本RNA浓度和OD260／280值。根据试剂盒说明书，取1 μg总RNA逆转录成cDNA。配置Real-time PCR反应体系：Mix（2×）10 μL，Rox（50×）0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，DEPC水7.8 μL，cDNA 1 μL。引 物 序 列CXCR-4：上 游AACTGAACGCTCCAGAATGT，下游GAGAAACCAC ACAGCACAAC；SDF-1：上游GGCTTTGAGGGAGG GTTT，下游TGCGGAGGAATGACTTCTG；MMP-3：上游5'-GGCACCAGTCAACCTCAA-3'，下游5'-CCAT CTACACAGAGACAGTTACTT-3'；MMP-9：上游5'-GCTGCTCCAACTGCTGTA-3'，下游5'-CATCCAAT AAATTCCTCTGTCCCTA-3'；MMP-13：上游5'-GCT AAGGCAGACATAGTAAGGTAGAT-3'，下游5'-ACA CATCAGTAAGCACCAAGT-3'。扩增条件为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火34 s，持续40个循环，最后95℃15 s、60℃延伸1 min。以β-actin为内参基因，计算各目的基因2-ΔΔCt，比较各目的基因mRNA相对表达水平。

2.8 Western blot法检测各组滑膜细胞中SDF-1和退变软骨细胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表达 收集各组细胞，加入含1 mmol／mL PMSF的RIPA裂解液提取各组总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转印至PVDF膜上，室温封闭1 h，分别用SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，滴加ECL显影液曝光显影。

2.9 统计学方法 运用SPSS 22.0软件进行分析。数据符合正态分布，用（±s）表示，采用one-way ANOVA分析，方差齐用LSD检验，方差不齐用Games-Howell法检验；不符合正态分布以中位数（四分间距位）表示，采用非参数检验。

3 结 果

3.1 3组大鼠滑膜细胞上清液中SDF-1含量比较

见图1。

图1 3组大鼠滑膜细胞上清液中SDF-1含量比较

3.2 3组大鼠滑膜细胞SDF-1 mRNA和蛋白表达比较 见图2、图3。

图2 3组大鼠滑膜细胞SDF-1 mRNA表达比较

图3 3组大鼠滑膜细胞SDF-1蛋白表达比较

3.3 3组退变软骨细胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表达比较 见图4、图5。

图4 3组退变软骨细胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表达比较

图5 3组退变软骨细胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表达比较

4 讨 论

OA通常为关节内的局部炎症常伴随关节滑膜炎，滑膜通过分泌各类因子进入关节腔内，从而参与调节软骨及软骨细胞外基质的代谢活动。滑膜的肥大通常预示着关节的炎症和软骨及其基质的降解［15］。滑膜可以分泌基质降解酶直接参与软骨细胞外基质的降解，同时可启动其他软骨降解的信号通路，使得软骨破坏［16］。

SDF-1是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白，可由骨髓基质细胞、骨髓内皮细胞等产生［17-18］。SDF-1在人体内有两种受体，CXCR4和CXCR7。在趋化因子中，SDF-1是CXCR4的唯一配体，KOA患者关节滑膜细胞会分泌SDF-1到滑液中［19］，SDF-1可与软骨细胞上已存在的CXCR4结合从而影响软骨细胞的增殖、分化和成熟。有研究指出SDF-1可通过结合软骨细胞表面的CXCR4受体，从而激活细胞外信号调节酶（Erk）及细胞外信号调节酶相关激酶（p38 MAPK）等信号通路，导致基质金属蛋白酶（MMP）-3、9、13的合成增加，使得软骨细胞外基质破坏［19-20］。OA患者关节液中SDF-1的浓度显著高于健康人，且浓度与严重程度成正比［21］。但SDF-1对相关MMP的诱导只对软骨细胞有效而对滑膜细胞无作用［22-23］。总之，SDF-1／CXCR4信号通路在KOA患者的病理进程中具有重要作用。

本研究发现OA滑膜细胞上清液中SDF-1含量明显高于正常滑膜细胞上清液组，经过荣筋拈痛方含药血清干预后SDF-1含量降低。进一步采用Real-time PCR和Western blot法，从基因和蛋白两个方面检测滑膜细胞中SDF-1表达情况，发现与空白组相比，模型SDF-1表达明显增多，而经过荣筋拈痛方含药血清治疗后SDF-1表达量明显下降。与此同时，本研究同时采用Real-time PCR和Western blot法检测血清干预后的滑膜细胞上清液对退变软骨 细 胞CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA和蛋白的影响，结果发现与空白组相比，模型组CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表 达 明 显 增多，经过滑膜细胞上清液干预后CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表达量明显下降。可见，荣筋拈痛方可能是通过调节滑膜细胞中SDF-1和软骨细胞中CXCR4表达，进而调节软骨细胞中MMP-3、MMP-9和MMP-13表达，起到防治KOA的作用，但是否是唯一途径，尚需要后期研究进一步验证。