耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌流行病学分析

陈烨 孙守栋 周芳美 杨雪静

肺炎克雷伯菌属于革兰阴性条件性致病菌，可引起肺炎、神经系统感染、肝脓肿、皮肤软组织感染、泌尿系感染及败血症等多种临床感染［1］。碳青霉烯类抗生素是治疗产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科感染的首选药物［2］，但随着该类抗生素的广泛使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）逐渐在各个国家及地区流行［3-4］，成为临床治疗的难点。如同时携带毒力因子，则对临床治疗构成严重威胁［5］。肺炎克雷伯菌毒力因子主要分为脂多糖、荚膜、铁摄取系统相关因子、外膜孔蛋白、尿囊素代谢相关基因等［5］，其中荚膜是重要的毒力因素，可促进菌株的黏附、抗吞噬、抗血清杀菌和远处定植［6］。为进一步明确本地区CRKP菌株耐药特点及其携带毒力因子的情况，作者对临床分离的CRKP菌株进行耐药表型及毒力因子检测。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2019年8月至2020年1月浙江中医药大学附属第一医院分离的CRKP菌株43株，剔除同一患者重复菌株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 主要试剂及仪器 细菌核酸提取盒、10×Ace Taq PCR Buffer（含Mg2+）、dNTP mix、Ace Taq与DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；质谱仪（Bruker）、Vitek-2 Compact 全自动微生物分析系统（法国生物梅里埃公司）、PCR 仪（美国 Bio-Rad 公司）、电泳仪及紫外凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；扩增引物合成及PCR产物测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.3 菌株鉴定 挑取血平板上24 h培养的菌落，涂布细菌于靶板，经MALDI-TOF质谱仪鉴定确认，鉴定率需达到2.0以上。

1.4 药敏试验 采用Vitek-2 Compact微生物分析系统进行药敏试验，琼脂稀释法确认碳青霉烯类药物敏感性，药敏结果采用美国临床和实验室标准化协会（CLIS）推荐标准进行判断。

1.5 高黏液表型检测 用接种环挑取血平板待测菌株，挑起的黏液丝长度若≥5 mm，为黏液丝试验阳性，重复≥3次确定为高黏液菌株。

1.6 毒力因子PCR扩增及序列分析 采用PCR检测荚膜血清型K1、K2、K57、K5、K20、K54，毒力基因uge、wabG、ycf、ureA、fimH、rmpA、rmpA2、aerobactin、iucA、peg-344、magA、wcaG、ybtA、kfuB、iroB、alls、iutA、entB，Hcp和外膜孔蛋白Ompk35、Ompk36基因。阳性产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序，序列与GenBank数据库比对。Hcp引物由Primer5软件设计而成（Hcp-F：CCACATTCACCAGGAAACCC；Hcp-R：GCATCGGACAGCCAAAGG）。反应体系、反应条件及引物合成参照文献［7-11］。

2 结果

2.1 科室及临床来源分布 CRKP菌株来源及科室分布见表1、表2。

表1 CRKP标本分布

表2 CRKP科室分布

2.2 CRKP药敏结果 43株菌对头孢菌素、β-内酰胺酶抑制剂、碳青霉烯类耐药率最高，对氨曲南、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、多西环素及米诺环素耐药率均>90%，对替加环素及粘菌素耐药率较低。见表3。

表3 CRKP耐药性情况

2.3 高黏液及荚膜型检测 黏液丝试验显示16.3%菌株为高黏液表型。发现1株K5荚膜阳性菌株，且为高黏液表型，未检出其他荚膜血清型。

2.4 毒力基因检测 18种毒力基因中uge、wabG、ycf、ureA、entB及fimH基因检出率最高，均>90%，未检测到iroB、alls、magA和wcaG基因。见表4。携带12种毒力基因菌株所占比例最高，均携带uge+wabG+fimH+rmpA+ycf+ureA+ybtA+iutA+entB+rmpA2+iucA+peg-344基因。见表5。

表4 CRKP毒力基因携带情况分析

表5 CRKP携带毒力基因种数分析

2.5 Hcp、Ompk35、Ompk36基因检测 4.7%菌株缺失Hcp基因，9.3%菌株缺失外膜孔蛋白基因，2株缺失Ompk35、Ompk36和Hcp基因菌株未检测到毒力基因。见图1、图2。

图1 Hcp基因产物测序峰图

图2 Ompk36基因电泳图

3 讨论

肺炎克雷伯菌是引起社区获得性及院内感染的重要肠杆菌科细菌，随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，CRKP不断增多，耐药性逐渐增强。中国细菌耐药性监测报告显示，2017、2018年肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为20.9%、24.0%和25.0%、26.3%，呈逐步上升趋势［12-13］。CRKP对临床常用抗生素耐药率高，仅对粘菌素和替加环素显示出较好的敏感性，产碳青霉烯酶是CRKP耐药的主要机制之一，转座子、质粒等遗传元件传播可使CRKP感染爆发流行。本资料结果显示，CRKP对头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、单环内酰胺类、多肽类等均有不同程度耐药，且多为ICU患者，预后不佳，病死率较高，给临床抗感染治疗带来困难。

CRKP可通过铁摄取系统毒力因子（aerobactin、iutA、iucA、ybtA、entB、iroB、alls、kfuB）、黏附因子（fimH、mrkD）、荚膜因子（uge、wabG、ycf）、毒素因子（magA、rmpA、rmpA2、wcaG）、尿囊素调节因子（ureA）等增加黏附、侵袭、抗吞噬等能力。将aerobactin基因插入低毒力肺炎克雷伯菌可增强肺炎克雷伯菌毒力与侵袭性。李喜红等［14］发现CRKP菌株aerobactin基因携带率较低，本资料中仅发现1株携带aerobactin基因菌株，与其结果相符。CANDAN等［15］发现>80% CRKP菌株含有黏附因子、铁摄取系统毒力基因，本资料中>74% CRKP菌株携带uge、wabG、ycf、entB、ureA、fimH、ycf、ybtA、iucA、iutA、rmpA2基因，这些因子不仅可以增强黏附、侵袭力，且能够表达自我保护成分，对菌株致病性具有重要意义。有报道称rmpA、rmpA2、iroB、iucA及peg-344能够作为高毒力肺炎克雷伯菌的鉴定指标，准确率>95%［16］，本资料未发现此类菌株，可能与肺炎克雷伯菌获得高耐药表型时丢失毒力因子以及高毒力肺炎克雷伯菌难以获得耐药质粒有关。

荚膜多糖是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子，可对抗中性粒细胞的吞噬作用，其中K1、K2、K57、K5、K20和K54荚膜型与人类的侵袭性感染密切相关。K1荚膜型易见于肝脓肿、菌血症等，K1、K2及K5荚膜型致病性强，且与严重感染有关。耐碳青霉烯类高黏液肺炎克雷伯菌（CR-HMKP）会引起难以治愈的感染，报道称高黏液菌株K抗原检出率达85%［17］，本资料中，7株CR-HMKP菌株仅1株检测到K5荚膜型，考虑可能存在其他荚膜型亚型或高耐药表型减弱了荚膜型的表达；另外K5荚膜型CR-HMKP菌株携带10种毒力基因，且为ICU患者，糖尿病慢性病史，住院时间长，有多种抗生素使用及侵袭性操作史，治疗效果不佳，应引起临床高度重视。Hcp是VI型分泌系统（T6SS）核心组成部分，在细菌的致病性发挥重要作用，DU等［17］发现携带Ompk36基因的菌株毒力较强。本资料中Hcp、Ompk35和Ompk36基因阳性率高，同时Ompk35、Ompk36和Hcp基因缺失菌株未检测到毒力基因，3种基因缺失是否影响菌株毒力基因携带需进一步探究。