人工远端肢体缺血再灌注对APAP诱导小鼠肝损伤的保护作用研究

郑 伟，宋晓雪，严 翔，张智勇，常虎林

（陕西省人民医院肝胆外科，西安 710068）

对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）诱导的急性肝损伤是药物诱导的肝损伤及肝衰竭的主要原因[1]。目前对早期药物性肝损伤的治疗主要是服用解毒药N-乙酰半胱氨酸（NAC），病人如果不及时接受NAC 治疗则会导致严重的肝损伤，从而进一步发展成肝衰竭远端肢体缺血再灌注处理是近年来研究发现的能有效抵抗缺血再灌注损伤从而对心脏和肝脏起到保护作用的一种方法[3-4]。根据其在靶器官缺血前还是缺血后处理分为远端肢体缺血再灌注预处理（R-IPC）和远端肢体缺血再灌注后处理（R-IPOST）。基于R-IPC 和R-IPOST 对远端器官缺血再灌注损伤具有一定的保护作用[5]，本研究旨在探究R-IPC 和R-IPOST 在APAP 诱导的药物性肝损伤中的作用研究, 拟为急性药物性肝损伤的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 4～5 周龄、体重约20～26 g 的雄性C57BL/6 小鼠购买自陕西省人民医院实验动物中心[许可证号：SYXK（陕）2016-006]，并在该中心饲养。小鼠的饲养及监管严格按照陕西省人民医院伦理委员会规则执行。

1.2 仪器及试剂 TNF-α 和IL-6 检测试剂盒由深圳达科为生物技术有限公司提供。ALT 试剂盒、AST 试剂盒、GSH 试剂盒、SOD 试剂盒和MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技术有限公司提供。APAP 溶液的配制（将0.6g APAP 粉剂溶于100ml生理盐水中，在40℃水浴锅中晃动充分溶解、混匀，按300mg/kg 即50ml/kg 的剂量给药准备，每只小鼠约20g 重，平均给药剂量约1ml）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及模型制作：实验分组：①正常对照组：小鼠不做任何处理；②假手术组：小鼠远端缺血预处理后腹腔注射1ml 生理盐水；③APAP 组：小鼠腹腔注射1ml APAP 的生理盐水溶液；④R-IPC+APAP 组：小鼠远端缺血处理后 5min 后腹腔注射1ml APAP 的生理盐水溶液；⑤R-IPOST+APAP 组：小鼠腹腔注射1ml APAP 的生理盐水溶液后，进行远端缺血处理。各组小鼠均在APAP 暴露16 h 后处死，及时采集血液样本和肝组织样本。

远端肢体缺血再灌注处理：首先麻醉小鼠：将 25 mg 的氯胺酮和2.5 ml 甲苯噻嗪混合比例配制好麻药，给每只小鼠注射麻药，麻药的给药剂量为3～5 ml/kg；在双侧后肢股三角处剪毛，沿血管走行方向逐层切开皮肤、皮下组织，分离缝匠肌后部，游离出双侧股动脉待用。R-IPC 组用无损伤小血管夹夹闭双侧股动脉5 min 造成肢体缺血后，再松开血管夹，让血液再灌注5min,连续操作4 个循环，再腹腔注射1ml 的APAP 盐溶液（300 mg/kg 溶解于1ml 生理盐水中）。R-IPOST 是先腹腔注射1ml的APAP 盐溶液后，再进行4 个周期的肢体远端缺血再灌注。可通过足部的颜色及双下肢股动脉搏动情况来显示血液流动情况进而评价远端局部缺血的效果。

1.3.2 血清ALT, AST, TNF-α, IL-6 水平的测定：根据检测试剂盒说明书指示，测定血清ALT, AST,TNF-α, IL-6 水平。

1.3.3 肝组织病理学检查 ：取出分离后的肝脏组织利用甲醛溶液固定, 常规苏木精-伊红（H＆E）染色,观察肝组织病理学改变。

1.3.4 氧化应激程度的测定：根据检测试剂盒说明书指示，测定肝组织MDA, GSH, SOD 含量。

1.4 统计学分析 GraphPad Prism6.0 对数据进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）形式表示。多组的比较采用单因素方差分析,进一步组间比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 R-IPC 和 R-IPOST 对APAP 肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响 见图1。与对照组和假手术组比较，APAP 组炎性细胞浸润，肝窦拥挤出血，肝小叶中心广泛坏死，肝小叶结构破坏明显；与APAP组比较，可见R-IPC+APAP 组和 R-IPOST+APAP组小鼠肝脏肝细胞坏死减少，肝窦无明显拥挤现象，肝小叶中心未出现广泛坏死。2.2 R-IPC 和R-IPOST 处理对APAP 肝损伤小鼠肝功能、炎症水平和氧化应激程度的影响 见表1。与对照组和假手术组ALT, AST 水平相比，APAP组小鼠血清中ALT, AST 水平明显升高，差异均有统计学意义（t=12.520～19.730, 均P<0.05），提示小鼠药物性肝损伤造模成功。R-IPC+APAP 组血清ALT, AST 水平明显低于APAP 组，差异有统计学意义(t＝7.032, 3.432, 均P<0.05)。R-IPOST+APAP组血清ALT, AST 明显低于APAP 组，差异均有统计学意义(t＝4.981, 3.470，均P<0.05)。ALT, AST在R-IPC+APAP 组与R-IPOST+APAP 组间差异无统计学意义（t＝0.860, 0.231,P＞0.05)。

表1 远端缺血再灌注对APAP 诱导急性药物性肝损伤小鼠各指标的影响（±s）

表1 远端缺血再灌注对APAP 诱导急性药物性肝损伤小鼠各指标的影响（±s）

项 目正常对照组假手术组APAP 组R-IPC+APAP 组R-IPOST+APAP 组ALT(U/L)38.8±4.438.6±3.85 564± 621.73 742±519.73 410± 588.6 AST(U/L)28.6±3.527.8±4.24 647± 813.93 471± 631.43 546±499.5 TNF-α(pg/ml)45.0±5.247.2±4.2351.7 ± 52.3264.8± 70.4256.6± 48.1 IL-6(pg/ml)72.0±6.976.0±7.1929.7± 140.6738.7 ± 71.0775.4 ± 98.4 MDA (nmol/mg.prot)2.6±0.82.8±1.013.1± 1.78.9± 1.29.3 ±1.9 SOD(U/mg.prot)18.1±1.518.4±1.28.6± 1.111.0± 1.910.3± 1.6 GSH(U/mg.prot)14.2±1.014.6±2.57.9± 0.6 8.7±1.2 10.3±1.2

图1 R-IPC 和 R-IPOST 处理对APAP 诱导的肝组织的病理学变化的影响(HE 染色)

与对照组和假手术组比较，APAP 组小鼠血清TNF-α, IL-6 水平明显升高，差异有统计学意义（t＝12.150～14.310, 均P<0.05）。R-IPC+APAP组血清TNF-a, IL-6 水平明显低于APAP 组，差异均有统计学意义(t＝3.400, 3.602，均P<0.05)。R-IPOST+APAP 组血清TNF-a, IL-6 水平明显低于APAP 组，差异均有统计学意义(t＝2.924, 2.196，均P<0.05)。TNF-α, IL-6 在R-IPC+APAP 组 与R-IPOST+APAP 组间差异无统计学意义（t＝0.162,0.660,P＞0.05)。

与对照组和假手术组比较，APAP 组小鼠MDA含量明显增多，差异有统计学意义（t＝16.090,14.150,P<0.05）。R-IPC+APAP 组和R-IPOST+APAP组肝组织MDA 含量明显低于APAP 组，差异均有统计学意义(t＝3.483, 4.581，均P<0.05)。MDA在R-IPC+APAP 组与R-IPOST+APAP 组间差异无统计学意义（t＝0.347,P＞0.05)。

与对照组和假手术组比较，APAP 组小鼠SOD 及 GSH 活性均明显下降，差异均有统计学意义（t＝5.748～12.460, 均P<0.05）。R-IPC+APAP组SOD 明显高于APAP 组，差异有统计学意义（t＝3.043，P<0.05）；GSH 活性高于APAP 组，但差异无统计学意义（t＝1.622，P=0.18）。R-IPOST+APAP 组SOD 高于APAP 组，但差异无统计学意义（t＝1.940，P=0.12）；GSH活性明显高于APAP 组，差异有统计学意义（t＝3.702，P<0.05）。SOD, GSH 在R-IPC+APAP组与R-IPOST+APAP 组间差异无统计学意义（t＝0.488, 1.685, 均P＞0.05)。

3 讨论

肝脏是人体主要的代谢器官，其主要参与体内糖原储存，分解血液中的红细胞、蛋白合成以及解毒过程等功能[6-7]。由于其多方面生理功能导致其是许多药物毒性作用的靶器官[8]。APAP 在治疗剂量时是一种解热镇痛消炎药且具有安全性。但是过量时会使肝小叶中心的肝细胞发生坏死，严重时可致命。

远端局部缺血因其使用便捷成为临床中最具潜力的一种治疗手段[9]。组织的短暂缺血比如远端肢体缺血再灌注预处理和后处理，能对靶器官产生保护作用，使其免受缺血或其他损伤[10]。而远端肢体缺血再灌注预处理和后处理仅在干预时机上有差别，本次研究发现两种处理方式组间结果差异无统计学意义，都能降低APAP 诱导的肝脏损伤程度，减少炎症反应和氧化应激程度，起到相近的保肝作用。

炎症反应在APAP 诱导的肝毒性的机制中发挥着重要作用。既往研究发现APAP 处理能刺激机体分泌炎性因子，比如TNF-α, IL-1β 和IL-6 等，表明这些细胞因子在APAP 诱导的毒性作用中发挥潜在作用[11]。BLAZKA 等[12]人证明小鼠经过APAP 处理后TNF-α 的血清水平明显增加，使用TNF-α 抗体能够抵抗APAP 诱导的毒性作用。以往的研究表明远端缺血后处理对肝缺血/再灌注损伤或脂多糖诱导的肝损伤产生的炎性反应具有降低的效应[3-4]。本次研究结果表明R-IPC 和 R-IPOST能降低APAP 诱导肝损伤TNF-α 和IL-6 水平，具有抗炎作用。

氧化应激是APAP 诱导肝损伤的另一个重要原因。MDA 是脂质过氧化的代谢产物，其含量反映了机体的脂质过氧化程度[13]。而GSH，SOD 则是体内最重要的抗氧化物质，也是中和APAP 所致毒性的关键[14-15]。近年来，COSTA 等[16]人发现远端缺血预处理能抵抗肝脏和肾脏细胞的氧化性损伤。XIN 等[17]人也发现远端缺血后处理能降低非酒精性脂肪肝大鼠MDA 和SOD 的水平。本研究显示R-IPC 和R-IPOST 同样能够抑制APAP 诱导的氧化应激、改善氧化损伤，改善GSH 和SOD 水平，降低MDA 产生。

目前有报道称R-IPC 能减轻非酒精性脂肪肝大鼠遭受缺血再灌注损伤，其机制可能与诱导合成热休克蛋白 70（HSP70）的表达有关[18]。SHIN 等[19]人发现NF-κB 是远端局部缺血条件作用的一个靶点，NF-κB 的激活和核内转录可以被HO-1 抑制，从而发挥对脂肪肝细胞的保护作用。尽管如此，对于远端缺血处理降低肝脏再灌注或炎性损伤的机制仍未完全明确。

综上所述，R-IPC 和R-IPOST 能降低APAP 诱导肝损伤的炎症反应及氧化应激程度，对药物性肝损伤具有保护作用。本研究仅对远端肢体缺血再灌注处理对APAP 诱导肝损伤的保护作用进行初步观察，而涉及其中的分子机制仍有待进一步深入研究。