水稻根际解磷菌的分离鉴定与特性研究

聂 振，林思芹，林元山

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

长期不合理施用无机磷肥易生成难溶性沉淀，使我国南方水稻耕作底层土壤板结硬化的问题日益突出[1]。研究表明，土壤微生物可有效改善土壤质量；水稻根际接中微生物复合肥，水稻根际固氮菌、磷细菌及解钾菌的菌数高于土体1～2 个数量级[2]。解磷菌范围广泛，霉菌、放线菌、细菌均有分布，其中细菌解磷效果较好，种类多，如芽胞杆菌、假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌等[3-4]。假单胞菌JP2-3 在土壤中具有显著的解磷和硝态氮去除效应，并能促进黄瓜植株生长。解磷菌剂的应用能减少农田土壤磷素的流失[5]。解磷细菌的解磷机制十分复杂，其中，分泌小分子有机酸、无机酸溶解难溶性磷酸盐的“溶磷”为主，也有解磷菌分泌磷酸酶解磷，还有底物降解释放磷[6]。为此，深入研究解磷菌及其应用对水稻生产和土壤保护具有及其重要现实意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 培养基（1）有机磷筛选培养基[7]：蛋白胨10.0 g，氯化钠0.5 g，鸡蛋黄20.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂粉20.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，调pH 值 7.0～7.5，121℃灭菌25 min。（2）无机磷筛选培养基[8]：葡萄糖20.0 g，磷酸三钙10.0 g，氯化镁5 g，硫酸铵5.0 g，氯化钾0.5 g，琼脂粉20.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，调pH 值 7.0～7.5，121℃灭菌25 min。（3）斜面培养基：酵母浸膏 5.0 g，氯化钠 5.0 g，葡萄糖10.0 g，可溶性淀粉10.0 g，琼脂粉20.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，调pH 值 7.0～7.5，121℃灭菌25 min。（4）解磷基本培养基：葡萄糖2.0 g，硫酸铵0.5 g，磷酸三钙1.0 g，硫酸镁0.05 g，氯化钠0.05 g，氯化钾0.05 g，七水硫酸亚铁0.005 g，一水硫酸锰0.003 g，加蒸馏水至100 mL，调pH值 7.0～7.5，121℃灭菌25 min。（5）阿须贝无氮培养基：甘露醇10.0 g，碳酸钙 5.0 g，七水硫酸镁 0.2 g，磷酸二氢钾 0.2 g，硫酸钙 0.1 g，氯化钠 0.2 g，琼脂粉20.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，调pH 值 7.0～7.5，121℃灭菌25 min。（6）解钾培养基：三氯化铁0.005 g，碳酸钙0.1 g，磷酸氢二钠2.0 g，七水硫酸镁0.5 g ，硫酸铵1.0 g，蔗糖5.0 g，钾长石粉0.1 g，琼脂20 g，加蒸馏水至1 000 mL，调pH 值7.0～7.5。121℃灭菌25 min。

1.1.2 水稻根际土壤通过GPS 定位经纬度，在湖南省农业科学院至湖南农业大学一带水稻田大田（东经113°4′35″～113°4′47″，北纬28°11′41″～28°11′54″） 范围内，均匀分布采集根际土若干份，取样深度 5～30 cm，每份样品湿重200～300 g，置于无菌封口袋中，准确标记，尽快带回实验室进行土壤解磷菌株的分离。

1.2 方 法

1.2.1 解磷菌的初步筛选取10 g 新鲜土加入90 mL无菌水至250 mL 无菌三角瓶中， 在200 r/min 恒温振荡30 min 后，按10 倍稀释法依次配制10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤悬浮液，吸取100 μL 均匀涂布于有机或无机磷分离培养基的90 mm 培养皿中，每梯度设3～6 个重复，37℃培养3～7 d，观察是否出现解磷圈，测量解磷圈直径（D）和菌落直径（d），并计算溶磷圈的直径和菌落直径的比值（D/d），并接种斜面，4℃冰箱保存。

1.2.2 解磷菌的摇瓶复筛将初筛菌株接种于解磷基本培养基中，于37℃恒温摇床、200 r/min 的条件下培养6 d，发酵液在分离因素10 000 g 离心 5 min，以不接种培养基作为空白对照，上清液用钼锑抗比色法[9]测定可溶性磷含量，每处理设3 个重复。菌体磷按钒钼锑抗比色法测定[10]。

1.2.3 解磷细菌的鉴定（1）解磷菌形态、生理生化特征按平板观察。常规染色显微观察，参照《伯杰细菌鉴定手册》的方法进行。（2）16S rDNA 测序分析。高活性解磷菌株送苏州金唯智生物科技有限公司，进行16S rDNA 测序，构建系统发育树，确定种属。

1.2.4 菌株解钾能力鉴定将菌株接种至解钾培养基，37℃培养箱中培养4～7 d，观察是否有解钾圈。

1.2.5 菌株固氮能力鉴定将菌株接种至阿须贝培养基，37℃培养箱中培养4～7 d，观察菌株能否生长。

2 结果与分析

2.1 平板初筛

从水稻田中取回12 份土壤样品，分别进行无机磷降解菌和有机磷降解菌的单菌落分离，分别获得具有水解圈的无机磷降解菌79 株，有水解圈的有机磷降解菌287 株。经形态初步判断，无机磷降解菌以细菌为主，少量放线菌，霉菌和酵母菌未曾发现；有机磷降解菌种类分布较广，以细菌和霉菌为主，其次为放线菌，少量酵母菌。部分筛选菌落直观图片见图1。从图1a 可知，无机磷筛选培养基，以无机氮硫酸铵为氮源，营养匮乏，解磷菌在无机磷平板上菌落和溶磷圈较小，土壤无机磷降解菌菌落总数维持在（5.0±0.5）×107CFU/g 土壤；相反，从图1b 可知，因养分充足，在有机磷筛选平板上的菌落较大，水解圈也大，土壤有机磷降解菌菌落总数达（8.0±0.5）×108CFU/g。溶磷圈直径与菌落的直径之比（D/d）在1～2 之间，特别是无机磷培养基的溶磷圈难以测定，需要复筛确定解磷水平。由于耕地土壤板结主要是无机磷板结危害影响大，因而，重点研究无机磷的降解菌更有实际意义。

图1 解磷菌的平板初筛及显微观察

2.2 解磷菌的摇瓶复筛

将初筛菌株进一步接种于解磷基本培养基，于37℃恒温摇床、200 r/min 的条件下培养6 d 后，测定发酵液的可溶性磷含量，尽管平板初筛获得较多的单菌落，但摇瓶复筛的差异很大，有的菌落难以在解磷基本培养基中有效生长繁殖，有的解磷活性很低，甚至检测不出。解磷活性较高的部分菌株解磷能力结果见表1。从表1 可以看出，菌体磷在55 μg/mL 以内，发酵液水溶性磷均低于30 μg/mL，说明菌体在苛刻条件下，主要用于菌体磷的合成，用于自身代谢需要。发酵液的pH 值普遍低于初始培养基pH 值，一般处于pH 值 5.0～6.8，说明在现有培养基条件下，改变酸碱度的能力有限，但发酵液的pH 值高低与水溶性磷和菌体磷不成正相关关系，可能与菌体分泌小分子酸的强弱有关，其具体小分子酸的种类和强度有待进一步确定。菌株LSQ31 和NZ 204 的菌体磷和水溶性磷较高，特别菌株LSQ31 菌体磷达52.4 μg/mL，水溶性磷达26.9 μg/mL，总磷达79.3 μg/mL。有望深入基础研究、探索应用潜力。

表1 解磷菌对无机磷的降解利用分析

2.3 氮源对菌株LSQ31 解磷的影响

由于无机磷培养基中有机氮源匮乏，菌体生长较少，而且周期长。在水稻耕作施肥的情形下，水稻田既有有机肥也有无机肥，肥料中的氮源对解磷菌的生长繁殖及解磷效果有影响。图2 显示，在摇瓶发酵条件下，维持基本培养基不变（葡萄糖2.0%），单一更换不同的氮源，菌株LSQ31 在有机氮源的发酵液中的菌体磷、水溶性磷和总磷差异显著（P＜0.05，下同）；发酵液pH 值总体呈酸性。其中菌株LSQ31 在黄豆粕中的菌体磷达102.5 μg/mL，水溶性磷达44.8 μg/mL，总磷达147.3 μg/mL；发酵液浑浊度更深，pH 值 5.5，显示更多的生物量。菜籽粕是其次好的一种氮源，有利于解磷菌生长、解磷。

2.4 碳源对菌株LSQ31 解磷的影响

碳源是微生物菌体合成、产物合成和能量代谢的重要成分，也是构成菌体小分子有机酸的碳架。图3显示，在摇瓶发酵条件下，变更基本培养基中氮源为黄豆粕（0.5%），同时更换不同的碳源，菌株LSQ31在不同碳源发酵液中的菌体磷、水溶性磷和总磷差异较大，影响解磷效果降序次序是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖及可溶性淀粉。其中菌株在葡萄糖中的菌体磷达98.4 μg/mL，水溶性磷达46.8 μg/mL，总磷达145.2 μg/mL；葡萄糖和蔗糖二者的影响差异不大，麦芽糖、果糖和乳糖也比较接近。比较氮源、碳源对解磷的影响，显然有机氮源的影响更为明显。

图3 碳源对菌株LSQ31 解磷的影响

2.5 LSQ31 菌株的鉴定与保存

2.5.1 LSQ31菌株形态学观察将LSQ31 菌株接种于LB 培养基平板上进行培养24～72 h，菌落呈圆形，浅黄色不透明，表面粗糙、湿润、有晕环、无凸起；在显微镜下观察该菌为球状，无芽孢产生，运动，不产孢；经革兰氏染色观察其为革兰氏阴性菌株，如图1c 所示。

2.5.2 LSQ31菌株的16S rRNA序列分析LSQ31

菌株经测序以及在GenBank 进行BLAST 比对分析，LSQ31 菌株与Vogesella urethralisYM-1(NR169490.1)的同源性达99%。结果见图4，初步鉴定菌株LSQ31为Vogesella属，并且命名为Vogesellasp. LSQ31（福格斯氏菌LSQ31）。

图4 LSQ31 菌株系统发育树

2.6 LSQ31 菌株的生理生化特征

LSQ31 菌株能在LB 培养基上能生长良好，最适生长温度为37℃，生物量24 h 达到峰值；在pH 值 5.5～7.5，33～37℃能很好地生长，能好利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖、淀粉；能利用明胶、干酪素以及常规的有机氮源。菌株在LB 液体培养基培养15 d，仍然有生物活性；在LB 斜面培养基上4℃冰箱保存90 d 仍然存活；在LB 斜面培养基上室温保存40 d 仍然存活，90 d 后全部死亡。LSQ31 菌株能在无氮培养基上，可能有固氮功能；也能在解钾培养基上生长，也说明该菌具有一定的解钾能力。

3 结论与讨论

从水稻根际土壤中筛选出一株解磷活性较高的菌株LSQ31。该菌为革兰氏阴性球菌，无芽孢。经16S rDNA 测序分析，菌株LSQ31 鉴定为Vogesella 属，并且命名为福格斯氏菌（Vogesella sp.）LSQ31。该菌能利用多种碳源和有机氮源，具有与有机肥相互作用有效解磷，并改善土壤退化的潜力。

福格斯氏菌（Vogesella）的解磷作用，国内外鲜见报道。目前，土壤退化较为突出的问题为土壤盐渍化、土壤酸化、土壤板结和土壤重金属污染[11]。添加石灰治理土壤酸化、微生物、有机质可以有效修复土壤盐渍化、板结和重金属污染[12-13]。试验筛选的福格斯氏菌LSQ31 菌株能更好的利用黄豆粕、菜籽粕等有机氮源，以发挥解磷功效，预示该菌株与有机肥可以实现相互作用实现土壤修复，特别在土壤板结和重金属污染方面。该菌的解磷活性与不动杆菌解磷活性（143 μg/mL）相当[6]，具有进一步研究和应用的潜力。