羊小反刍兽疫抗体比对实验操作及注意事项

闫会章，杨聪伟

（饶阳县农业农村局，河北饶阳 053900）

小反刍兽疫俗称羊瘟，又名小反刍兽假性羊瘟、肺肠炎、口炎肺肠炎复合症，本病是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、接触性传染疾病，主要感染小反刍动物（特别是山羊和绵羊易感染），以发病急剧、高热稽留、眼鼻分泌物增加、口炎、腹泻和肺炎为特征。世界动物卫生组织（OIE）将本病定为A类疾病。发病率一般高达100%，严重时病死率可达100%，严重威胁着畜牧业的健康发展.为科学评价疫苗的免疫效果及其免疫抗体持续期，确保全县养羊业健康、稳定、持续发展，在我县采集部分（河北唯尊养殖有限公司、饶阳众悦羊场、饶阳佳浩家庭农场、饶阳寅兴羊场、饶阳王宁养殖场等羊场）免疫羊全血，并分离出血清，用阻断ELISA方法检测小反刍兽疫抗体。结果表明：全县小反刍兽疫免疫效果较好，免疫质量高；小反刍兽疫疫苗抗体持续时间至少达13个月以上，小反刍兽疫疫苗具有良好的免疫原性，可产生良好的免疫效果。现将羊小反刍兽疫抗体比对实验的注意事项及操作步骤介绍如下：

河北唯尊养殖有限公司、饶阳众悦羊场、饶阳佳浩家庭农场、饶阳寅兴羊场、饶阳王宁养殖场这5个养殖场均免疫过羊小反刍兽疫疫苗，且末次免疫日期都在21天以上，每个羊场采血15份，每份羊全血采自一只羊，分离出血清备用。

羊小反刍兽疫抗体检测的方法：小反刍兽疫病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒。

生产日期：2019.10.25

批准文号：020171912

有效期至：2020.10.25

保存方式：2℃～8℃保存

试剂厂家：青岛立见诊断技术发展中心。

需自备的试验用器材：96孔板、100微升及200微升的单道或多道移液器、吸头、酶标仪、生物安全柜、纯水或去离子水。

实验准备：试剂盒在使用前必须恢复至室温（20℃～25℃），加液前充分摇匀。整个实验操作过程均在生物安全柜内进行。阴性血清、羊小反刍兽疫阳性血清、样品稀释液和样品的分布如图所示，阴性对照（N）、阳性对照（P）、样品稀释液对照（Cm）和待检血清（S）所示：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N S3 B N S4 C P D P E cm F cm G S1 H S2

1 做实验时的注意事项

1.1 试剂盒在使用前必须恢复至室温（20℃～25℃），加液前充分摇匀。

1.2 需稀释的组分洗涤液20倍在稀释时应准确量取，如果发现有结晶应加热使其溶解后使用。

1.3 底物溶液应注意避光保存。

1.4 在操作过程中，尽量避免将气泡加入检测孔中。

1.5 终止液为稀硫酸溶液避免接触到皮肤或眼睛。

2 羊小反刍兽疫抗体比对实验的操作步骤

羊小反刍兽疫抗原包被板上羊小反刍兽疫操作步骤：

2.1 在A1和B1孔加入羊小反刍兽疫阴性血清各50微升；

2.2 在C1和D1孔加入羊小反刍兽疫阳性血清各50微升；

2.3 在E1和F1孔加入样品稀释液各50微升；

2.4 剩余孔加入25微升样品稀释液，然后加入25微升样品用于检测；

2.5 轻轻振匀孔中样品（勿溢出），37℃孵育60分钟；

2.6 将洗涤液20倍用纯水或去离子水做20倍稀释，即为工作浓度的洗涤液1倍；

2.7 甩干羊小反刍兽疫抗原包被板孔中的液体，每孔加入300微升洗涤液1倍，洗涤4次，在洗涤和加入下一个试剂前，避免孔壁变干；

2.8 将酶标抗体5倍用样品稀释液做5倍稀释，即为工作浓度的酶标抗体1倍；每孔加入50微升的酶标抗体1倍；

2.9 37℃孵育30分钟；

2.10 甩干羊小反刍兽疫抗原包被板孔中的液体，每孔加入300微升洗涤液1倍，洗涤4次，在洗涤和加入下一个试剂前，避免孔壁变干；

2.11 每孔加入50微升底物溶液；

2.12 室温下避光孵育15分钟；

2.13 每孔加入50微升的终止液终止显色反应；

2.14 使用酶标仪测定450纳米波长处的OD值。

通过结果计算得出以下对比结果：

5个养殖场抗体检测结果显示

通过对比试验得知，小反刍兽疫疫苗具有良好的免疫原性，抗体合格率高，抗体维持时间长，可产生良好的免疫效果；鉴于本病发病率高，致死率高，得病后无特效的治疗方法，所以建议养殖户在羊群健康时非常有必要作此免疫，以降低该病的发生。