当归-骨碎补配伍治疗骨折三期辨证中期的网络药理学机制

李志鸿， 叶学劲， 刘经鹏， 陈文阳， 滕居赞

（1.广州市荔湾区中医医院，广东广州510000；2.广西中医药大学，广西南宁530011；3.广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530000）

骨折常导致骨折不愈合[1-2]。中医学将骨折治则分为三期，骨折中期相当于原始骨痂形成期，此期的特点是肿痛较前期减轻，但瘀肿尚未消尽，筋骨虽连而未坚，故此期宜和营生新、接骨续损。骨折的愈合是从修复过程的起始直至骨折最终塑形完成为止的一个连续不断的过程。而骨折中期是连接初、后期的一个必不可少的“枢纽”。一旦骨折中期愈合欠佳，将会导致骨折初期治疗尽弃，而骨折后期过程停滞，最终导致骨折不愈合。骨折中期治疗常用的代表中药为当归、骨碎补[3]。当归始载于《神农本草经》，为伞形科多年生草本植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，有补血活血、调经止痛、润肠的作用。骨碎补始载于《药性本草》，为水龙骨科多年附生蕨类植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.SM.的干燥根茎，其功效主要为活血续伤、补肾强骨。当归、骨碎补对推进骨折愈合进程有明显的作用[4]，骨折的愈合与血液供应、骨膜完整性破环程度、断端的接触、周围肌群的影响相关。中药因其成分复杂，对其有效成分的研究开展受限，而中药网络药理学则可从中药的化合物-靶向-疾病关系反映、阐述其之间的相互作用。本研究系统性运用网络药理学方法综合探讨当归-骨碎补可能的化合物构成，并分析当归-骨碎补配伍治疗骨折三期辨证中期可能的药理学机制，以期为下一步的药物基础研究提供参考，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 当归-骨碎补的化学成分借助中药系统药理 学 分 析 平 台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分别检索当归、骨碎补的所有化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%[5]，类药性（DL）≥0.18[6]为筛选标准，筛选当归、骨碎补中的活性成分，最后得到当归2个、骨碎补18个化合物。

1.2 当归-骨碎补化合物-靶点网络的构建将通过TCMSP平台按照筛选标准所得的当归-骨碎补的20个化合物及其258个靶点，应用Cytoscape3.7.1开放源码的生物信息分析软件构建化合物-靶点网络图。

1.3 当归-骨碎补靶蛋白相互作用网络的构建应用STRING数据库10.5线上软件（http：//string-db.org），将筛选所得的当归-骨碎补靶点上传，选择智人种（homo sapiens），应用Cytoscape 3.7.1软件构建当归-骨碎补靶蛋白互作网络图。

1.4 闭合骨折相关靶点数据库的构建基于CTD（https：//ctdbase.org）和GeneCards（https：//www.genecards.org）数据库综合筛选挖掘闭合骨折相关靶点，构建闭合骨折相关靶点数据库，与当归-骨碎补化合物靶点进行对比分析，筛选出当归-骨碎补作用于闭合骨折的靶点，应用Venny 2.1在线工具（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/）绘制韦恩图。

1.5 当归-骨碎补化合物靶点与闭合骨折相关靶点网络图的构建根据当归-骨碎补化学成分-靶点预测结果和靶点-疾病预测结果，应用Cytoscape 3.7.1软件中的“Merge”功能，将2个预测结果合并成“化学成分-靶点-疾病”网络图，进行全局化可视网络分析。通过Network Analysis功能计算网络的拓扑参数，分析其相互关系。

2 结果

2.1 有效化合物的筛选本研究搜索到化合物共196个，其中，当归化合物125个，骨碎补71个。最后筛选得到当归2个、骨碎补18个化合物，主要活性成分的OB和DL值见表1。

表1 当归、骨碎补主要有效化合物信息Table 1 Data of main effective constituents from Radix Angelicae Sinensis and Rhizoma Drynariae

2.2 当归-骨碎补化学成分潜在靶点预测及相互作用筛选当归、骨碎补化合物的有效靶点共258个，构建“化合物成分-作用靶点”网络图，见图1。当归-骨碎补化合物靶点蛋白互作网络见图2。

图1 当归-骨碎补化合物-靶点网络图Figure 1 Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae constituent-target network

图2 当归-骨碎补靶点蛋白互作网络图Figure 2 Target protein interaction network of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae

2.3 闭合骨折相关靶点数据库的构建以“Closed Fracture”或“Fracture Closed”作为关键词在CTD、GeneCards数据库中查询，初步筛选出CTD数据库72个，GeneCards数据库2 950个，共3 022个候选基因。根据“Reference Count”值取GeneCards数据库中相关度最高的前200个结果，其中与闭合骨折靶点有25个重合，分别为VEGFA、RB1、PPARG、MET、ESR1、CA2、AR、MMP2、IL-6、TP53、VCAM1、PTGS2、NOS2、ABCC1、MAPK3、MAPK1等。当归-骨碎补靶点与闭合骨折靶点的韦恩图，见图3。当归-骨碎补对闭合骨折作用靶点的蛋白互作网络，见图4。当归-骨碎补化合物-靶点-闭合骨折的全局性网络，见图5。

图3 当归-骨碎补靶点与闭合骨折靶点的韦恩图Figure 3 Venn diagram of targets related with Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae and closed fracture

图4 当归-骨碎补对闭合骨折作用靶点蛋白的互作网络Figure 4 Interaction network of target proteins of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture

图5 当归-骨碎化合物-靶点-闭合骨折网络图Figure 5 Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae constituent-target-closed fracture network

2.4 当归-骨碎补对闭合骨折作用靶点的京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析和基因本体论（GO）分析将当归-骨碎补对闭合骨折的25个作用靶点上传ClueGO插件中进行GO分析，GO分析注释图见图6~8。得出111个生物学过程（biological process，BP），包括：对雌激素的反应（response to estrogen），对缺氧的反应（response to hypoxia），转录的正调节，NDA模板化（positive regulation of transcription，DNA-templated），细胞对缺氧的反应（cellular response to hypoxia）等；19个细胞组成（cellular component，CC），包括细胞膜穴样内陷（caveola）、细胞外空隙（extracellular space）、细胞质（cytosol）等。24个分子功能（molecular function，MF），包括：酶结合（enzyme binding）、血红素结合（heme binding）、转录因子逆结合（transcription factor binding）、相同的蛋白结合（identical protein binding）等。KEGG通路富集分析发现，当归-骨碎补作用于闭合骨折的靶点的通路有51条，主要包括：癌 症 通 路（pathways in cancer）、膀 胱癌（bladder cancer）、低氧诱导因 子1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路（PI3K/Akt signaling pathway）、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路（VEGF signaling patway）等等，见图9。

图6 当归-骨碎补对闭合骨折作用靶点的GO分析Figure 6 GO analysis results for the targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture

图7 当归-骨碎补对闭合骨折作用靶点的GO分析结果（P＜0.05）Figure 7 GO analysis results for the targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture（P＜0.05）

图8 当归-骨碎补治疗闭合骨折靶点的GO分析结果饼状图（P＜0.05）Figure 8 Pie chart of targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture by GO analysis（P＜0.05）

图9 当归-骨碎补对闭合骨折作用靶点的KEGG分析的气泡图Figure 9 Bubble diagram for targets of Radix Angelicae Sinensis-Rhizoma Drynariae for closed fracture by KEGG analysis

3 讨论

骨折属于中医学“骨折病”的范畴。《正体类要》指出：“肢体损伤外，则气血伤于内，营卫有所不贯，脏腑由之不和。”开创了“气血学说”和“平补法”的理论基础，主张以补气血、活血、补肝肾为主的治法。当归-骨碎补作为骨折三期辨证中期治疗常用的药物配伍，其临床疗效肯定。现代药理学研究证实，当归具有抗凝血、止血[7]，改善血液循环[8]，促进造血[9]的作用；骨碎补具有促进成骨细胞生成[10]、矿化[11]，促进骨折愈合[12]的作用。但目前国内对当归、骨碎补促进骨折愈合机制的研究多局限在当归多糖、当归提取物，骨碎补总黄酮[13-14]、骨碎补提取物这一类化合物，且对当归-骨碎补在骨折愈合的体内代谢作用机制研究鲜见。故本研究通过网络药理学对当归-骨碎补配伍治疗骨折三期辨证中期的机制进行可能性推断。

本研究筛选最后得到当归2个、骨碎补18个化合物。其中：β-谷甾醇（beta-sitosterol）可能通过改变体外成骨活性而改善骨脆性和骨折形态[15]。山柰酚（kaempferol）能抑制破骨细胞分化并促进其凋亡，促进骨细胞样MG-63细胞系的分化，并减弱TNF在MC3T3-E1小鼠成骨细胞系中的信号传导[16]，亦可通过促进成骨细胞功能和抑制骨髓中的脂肪细胞形成来预防去卵巢大鼠模型诱导的骨质流失[17]。柚皮素（naringenin）可作为超氧化物清除剂，有助于内源性抗氧化防御系统保护骨骼免受骨质疏松症的侵害，而含有柚皮素的假蒟（Piper sarmentosum）的提取物则具有抑制脂肪组织和骨中11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）表达和活性能力，从而恢复骨骼结构和强度[18]。木犀草素（luteolin）可以通过促进糖皮质激素诱导的骨质疏松症中的成骨细胞分化、矿化和增殖来增加骨形成，其通过抑制活性氧（ROS）的过度生成来抑制成骨细胞增殖，增强成骨标志物的表达以促进成骨细胞分化和增加骨保护素（OPG）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）比率以维持骨量，从而减弱成骨细胞凋亡。此外，木犀草素可增强OPG/RANKL比率和成骨细胞分化减轻糖皮质激素诱导的骨质疏松症[19]。本研究分析结果表明，当归-骨碎补化合物主要以甾醇类、黄酮类为主，且与目前现有研究结果一致。此外，还包括黄烷酮类（flavanones）、固醇类（stigmasterols）、海州骨碎补苷（marioside_qt）等。

对当归-骨碎补对闭合骨折的25个作用靶点进行GO分析，涉及111个生物学过程、19个细胞组成、24个分子功能。KEGG通路富集发现当归-骨碎补作用于闭合骨折的通路有51条，主要明确涉及HIF-1信号通路、TNF信号通路、PI3K/Akt信号通路、VEGF信号通路等。氧供是影响骨折愈合的重要因素，HIF-1在调节氧稳态中起关键作用，研究[20]发现，缺氧条件下MC3T3-E1小鼠成骨细胞活力下降，HIF-1α蛋白表达增加，HIF-1α转染的MC3T3-E1细胞的存活率高于未强制表达HIF-1α的细胞，HIF-1α在MC3T3-E1细胞系中的强制表达通过抑制细胞凋亡减弱了缺氧诱导的成骨细胞活力下降。TNF-α在干细胞向成骨分化过程中扮演着双重角色（促进或抑制成骨分化），而TNF-α的作用时间，作用浓度及作用的干细胞类型又可能是决定其促进或抑制干细胞成骨分化的主要因素[21]。PI3K/Akt信号通路是调节细胞增殖、分化、存活、迁移和代谢过程的最为重要的一个信号通路。越来越多的证据表明，骨组织中的许多信号分子能够选择性激活PI3K/Akt信号通路的相关基因，通过调控成骨细胞和破骨细胞的活动，破坏骨重建过程中骨形成与骨吸收的动态平衡[22]。miR-28-3p可以通过活化PI3K/Akt信号途径而加速骨折愈合过程[23]。miR-181a/b-1通过调节第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因（PTEN）/PI3K/Akt轴和线粒体代谢促进骨生成[24]。VEGF是一种重要的信号蛋白，参与血管生成（胚胎循环系统的新生形成）和血管生成（从已存在的血管系统中生长血管）。研究[25]表明，骨碎补可通过激活VEGF/VEGFRs的表达，促进骨折愈合。早期骨质疏松细胞（Osterix+）的VEGFA，但不是成熟的成骨细胞/骨细胞（Dmp1+），对于快速骨膜血管生成和编织骨形成的骨损伤时至关重要。而在损伤时需要来自另一种细胞来源而非来自成骨细胞谱系的VEGFA，以获得最大的皮质缺损髓内血管生成和骨生成[26]。因此，预测当归-骨碎补可能通过调控HIF-1、TNF、PI3K/Akt、VEGF等信号通路促进骨折三期辨证中期的愈合。

综上所述，本研究以当归-骨碎补主要活性成分为研究对象，借助网络药理学方法，通过分析其主要的活性成分，构建“化合物-靶向-疾病”的关系，初步在分子层面展示了当归-骨碎补作用于骨折三期辨证中期的机制，且大部分预测结果与现代药理学研究相符，为科学用药提供了指导；然而，本研究仅在分子水平初步预测当归-骨碎补的作用机制，缺乏入血移行成分预测，且缺乏药物相互作用机制研究，具有一定的局限性，因此，有待进一步加以理论完善以及实验验证。