温阳活血解毒方稳定ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块机制研究

张涛涛， 黄娜， 余锋， 刘南， 洪永敦

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病，是急性心脑血管疾病发展的病理基础。AS斑块破裂和血栓形成是急性心血管事件的主要发病原因。《中国心血管健康与疾病报告2019概要》[1]报道，心脑血管疾病是我国居民死亡的首要因素，占总死亡率的70%以上，且随着人口老龄化的增长，其患病率和死亡率仍处于上升阶段。目前，西医治疗AS以他汀类药物为主，他汀类药物能显著降低患者心血管事件的发生率，但长期使用会增加肝损害和肌病等不良反应的发生，导致AS患者的疗效欠佳[2]。临床实践证明，中医药在防治AS等疾病方面具有整体调节、毒副作用小、疗效显著等优点，因此，加强中医药对AS易损斑块的研究具有重要意义。本课题组前期临床及实验研究证实，温阳活血解毒方可抑制血管新生、改善血管内皮功能及稳定易损斑块，对冠心病急性冠脉综合征有较好的治疗作用[3-9]。小凹蛋白1（Caveolin-1）是位于小凹上的标志蛋白，在细胞信号转导中起枢纽作用[10]。细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）是控制AS炎症反应的重要细胞信号转导通路，Caveolin-1蛋白表达上调能够激活ERK1/2通路，以磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）形式存在，进而抑制炎症反应和促进血管平滑肌细胞凋亡，减轻AS[11-12]。推测干预Caveolin-1/ERK1/2信号通路的蛋白表达可能影响AS的病理过程。为进一步探讨温阳活血解毒方稳定AS斑块的作用机制，本研究观察了温阳活血解毒方对AS易损斑块Caveolin-1、p-ERK1/2蛋白和mRNA表达的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料SPF级雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠50只，8周龄，体质量12~16 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK（粤）2018-0092，动物质量合格证号：44005800010047。动物饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级动物实验室，温度21~25℃，湿度40%~70%，光照时间为12 h日夜交替照明。高脂饲料（含脂肪质量分数为21%、胆固醇质量分数为0.15%），已经钴-60灭菌处理，购自广东省医学实验中心。

1.2 药物温阳活血解毒方由党参10 g、薤白15 g、桂枝10 g、法半夏10 g、川芎10 g、丹参15 g、柴胡10 g、黄芩10 g、连翘10 g、炙甘草5 g组成。药材饮片均购自广州中医药大学第一附属医院，由广州中医药大学实验中心药理研究所方坚松副研究员鉴定，并以高压灭菌蒸馏水稀释成质量浓度为3 g·mL-1的中药汤剂。辛伐他汀片，每片20 mg，由杭州默沙东制药有限公司生产，批号：H20191110。

1.3 试剂与仪器两步法RT-PCR试剂盒（大连宝生物功能有限公司）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）；引物由上海博尚生物技术有限公司合成。人抗鼠Caveolin-1、p-ERK1/2抗体和兔抗鼠IgM抗体LS-C60748（美国R&D Systems公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（上海钰博生物科技有限公司，批号为20191125）。全自动生化分析仪（日本日立公司）；Eppendonrf-5332型PCR自动扩增仪（德国Eppendorf公司）；LightCycler2.0实时定量PCR仪（瑞士罗氏公司）；LightCycler 2.0冰冻切片机LEICA CM1900型（德国Leica公司）；BX41型光学显微镜、BX-51型偏振光显微镜（日本Olympus公司）；Biofuge Stratos型低温高速台式离心机（德国Heracus公司）。

1.4 造模、分组与给药给予50只SPF级ApoE-/-小鼠高脂饮食13周，构建AS模型。参考文献[9]，随机选取小鼠5只，用100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉处死，按照局部解剖方法打开胸腔，取主动脉根部作病理切片行苏木素-伊红（HE）染色，观察小鼠主动脉斑块形成的情况，判断动脉斑块形成及模型复制成功与否。AS模型成功建立后，按照随机数字表将其分为模型组，中药低、中、高剂量组及辛伐他汀组，每组9只。中药低、中、高剂量组分别给予温阳活血解毒方（对应剂量为14.08、28.16、56.32 g·kg-1·d-1，均按成人60 kg体质量临床剂量的1、2、4倍折算成小鼠等效剂量[13]）灌胃，辛伐他汀组给予辛伐他汀（2.6 mg·kg-1·d-1，按成人60 kg体质量常用量20 mg·d-1折算成小鼠等效剂量）灌胃，给药体积为20 mL·kg-1；模型组给予等体积生理盐水灌胃，给药体积为20 mL·kg-1。每天1次，共13周。

1.5 全自动生化分析仪检测血脂水平摘除小鼠眼球静脉采血，静置30 min，待血凝，以4 000 r·min-1离心15 min（离心半径13.5 cm），吸取上层血清0.5 mL左右，用干化学法在全自动生化仪上检测血清总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。

1.6 苏木素-伊红（HE）染色观察主动脉组织病理学变化小鼠处死后迅速打开胸腔，左心室逆行灌注液体至主动脉，迅速剥离自主动脉起始部、主动脉弓分叉处至降主动脉移行为胸主动脉段2～3 cm处，连通主动脉根部部分心肌组织一同剪下；冰水洗涤，将主动脉根部连同主动脉弓分叉血管立即置于体积分数4%中性甲醛溶液中固定24 h；以浓度体积分数75%乙醇脱水，置于二甲苯中透明后，浸蜡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，连续切片，厚度5 μm，切片展平贴于载玻片上烘干，进行HE染色。光学显微镜下观察各组小鼠主动脉组织的病理学变化。

1.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测主动脉组织中Caveolin-1、p-ERK1/2蛋白的表达情况分离小鼠主动脉并置入玻璃匀浆器中，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液+蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂配制的组织裂解液，在冰上研磨后离心取上清。将上清蛋白质用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并转膜后，50 g/L脱脂奶粉封闭液封闭1 h，加入相应抗体4℃过夜。磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗孵育1 h，显影后成像并拍照，最后用ImageJ软件分析各蛋白条带灰度值，结果以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示。

1.8 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测主动脉组织中Caveolin-1、p-ERK1/2 mRNA的表达情况采用TRIzol试剂一步法抽取小鼠主动脉组织总RNA，微量分光光度计检测RNA样品纯度。然后进行逆转录，RT-PCR反应体系及条件按试剂盒说明书进行。Caveolin-1上游引物序列为5’-TCTACAAGCCCAACAACAAGGCC-3’，下游引物序列为5’-TGCACTGAATCTCAATCAGGAAGC-3’，扩增片段长度360 bp；p-ERK1/2上游引物序列为5’-AACAGGTTGTTCCCAAATGC-3’，下游引物序列为5’-GCCAGAGCCTGTTCAACTTC-3’，扩增片段长度136 bp。以GAPDH作为内参照物基因，GAPDH上游引物序列为5’-CGGCTCAAGGG CATTCTAGGC-3’，下游引物序列为5’-TGAGGT CCACCACCCTGTTCCTG-3’。PCR扩增程序：95℃10 min；95℃15 s，55℃30 s，72℃30 s，循环40次。然后进行20 min的产物熔解程序，作熔解曲线分析，将不同浓度的定量的模板的对数和相应Ct值作图，结果判定：ΔCt=Ct-CtGAPDH，再采用2-ΔΔCt方法[14]计算mRNA的相对表达量。

1.9 统计方法采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析及图像处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析或独立样本T检验，多组间两两比较采用Bonferroni法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠主动脉组织病理学变化的影响图1结果显示：模型组血管壁破损，管腔内可见明显的粥样硬化斑块出现，向管腔突起，内膜连续性结构破坏。中药低、中剂量组主动脉斑块纤维帽变薄，脂核增大，斑块内可见明显胆固醇结晶沉积，平滑肌及胶原纤维减少，斑块处于不稳定状态。中药高剂量组及辛伐他汀组主动脉斑块未见明显破裂和出血，平滑肌细胞及胶原纤维成分较多，斑块内胆固醇结晶较少，呈不对称分布，斑块趋于稳定。

图1 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠主动脉组织病理学变化的影响（HE染色，×200）Figure 1 Effect of YBTR on pathological changes of aortic tissue in ApoE-/-mice（by HE staining，×200）

2.2 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影响图2结果显示：与模型组比较，中药高剂量组及辛伐他汀组TC、TG及LDL-C水平明显降低，HDL-C水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药中剂量组TC、LDL-C水平明显减低，差异均有统计学意义（P＜0.01），而TG、HDL-C水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，中药低剂量组TC、TG、LDL-C及HDL-C水平均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。与辛伐他汀组比较，中药高剂量组TC、TG、LDL-C、HDL-C水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影响Figure 2 Effect of YBTR on serum TC，TG，LDL-C and HDL-C levels in ApoE-/-mice

2.3 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠主动脉组织Caveolin-1、p-ERK1/2蛋白表达的影响图3结果显示：与模型组比较，中药高剂量组及辛伐他汀组主动脉组织中Caveolin-1蛋白表达水平明显升高，p-ERK1/2蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），而中药低、中剂量组主动脉组织中Caveolin-1表达水平有所升高，p-ERK1/2蛋白表达水平有所减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠主动脉Caveolin-1、p-ERK1/2蛋白表达的影响Figure 3 Effect of YBTR on the expression of Caveolin-1 and p-ERK1/2 in ApoE-/-mice

2.4 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠主动脉组织Caveolin-1、p-ERK1/2 mRNA表达的影响图4结果显示：与模型组比较，中药低、中、高剂量组及辛伐他汀组主动脉组织Caveolin-1 mRNA、p-ERK1/2 mRNA表达水平无明显变化，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图4 温阳活血解毒方对ApoE-/-小鼠主动脉Caveolin-1、p-ERK1/2 mRNA表达的影响Figure 4 Effect of YBTR on the expression of Caveolin-1 mRNA and p-ERK1/2 mRNA in ApoE-/-mice

3 讨论

动脉粥样硬化（AS）是指脂质在动脉内膜上大量沉积，形成粥样硬化斑块，导致内膜增厚、管腔狭窄的一种慢性炎症性疾病[15]。1999年，Ross明确提出AS是一种炎症性疾病，炎症反应贯穿AS的整个阶段[16]。越来越多证据表明，内质网应激与动脉粥样硬化斑块也密切相关[17-19]。Caveolin-1是位于小凹上的标志蛋白，在细胞信号转导中起枢纽作用[10]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是中药抗AS炎性机制研究的热点通路。ERK1/2是MAPK家族控制炎症反应的重要成员，亦是参与脂质代谢的重要细胞信号转导通路。研究[11]证实，抑制ERK1/2通路的激活可减轻AS。当血管内皮细胞受到炎性因子及脂多糖（LPS）刺激时Caveolin-1可激活ERK1/2，以其磷酸化形式（p-ERK1/2）存在。而ERK1/2的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至胞核的关键[12]，在内皮细胞诱导核因子κB（NF-κB）活化，促进炎性细胞增殖、迁移，加剧炎性反应[11]，同时，亦激活内质网应激下游的蛋白激酶R样内质网激酶-真核起始因子2α-活化转录因子4（PERK-eIF2α-ATF4）信号通路，促进血管平滑肌细胞凋亡，导致斑块形成，并影响粥样斑块的稳定性，在AS的发生发展中发挥重要作用[20]。研究亦发现，Caveolin-1的下调可致ERK1/2的过度激活[21]。而Caveolin-1的过度表达又可抑制ERK1/2信号 级 联[22]。Jia等[23]报 道Caveolin-1/ERK1/2通 路可调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移。故干预Caveolin-1/ERK1/2信号通路的蛋白表达可能成为防治AS的新靶点。

他汀类药物是目前临床上治疗AS首选的最基本的调脂药物，不仅可调节血脂，还可通过抗炎及保护血管内皮等作用防治AS，但长期服用有不同程度的肝损害和肌肉毒性等不良反应。其中，辛伐他汀可调节血脂紊乱，能延缓或逆转AS发病的进程，是公认推荐的降脂药物之一[24]，故本研究选用辛伐他汀为阳性对照药物。

随着中医药对AS研究的不断深入，中药以其疗效显著及不良反应少，在AS的临床治疗中发挥了独特的优势。中医学认为AS病变性质总属本虚标实。其中，气血阴阳的虚衰为本虚，气滞、血瘀、痰浊为标实，治当标本同治。温阳活血解毒方是我们研究团队基于中医辨证思想和组方原则，结合多年临床实践经验及AS的病理机制总结出的防治AS的临床验方。方中：桂枝、薤白、法半夏奏温阳通脉、通阳散结、行气导滞之效，柴胡、黄芩、连翘清热解毒，川芎、丹参活血化瘀，党参、炙甘草补中益气。全方寒温并用，标本兼顾，共奏温阳活血解毒之功。本课题组系列临床研究结果表明，温阳活血解毒方干预急性冠脉综合征、稳定动脉斑块有较好的临床疗效[3-7]，可有效改善患者临床症状，减轻炎症因子水平，有助于提高患者的生活质量。初步动物实验研究证实温阳活血解毒方能减少AS斑块内泡沫细胞、增加斑块内平滑肌和胶原成分，降低斑块内新生血管的表达，稳定AS斑块[9]，而其确切的作用机制及相关通路尚不明确。

ApoE-/-小鼠由于遗传因素损伤，导致脂蛋白代谢异常，高脂饮食即可形成弥漫纤维增殖性AS损伤病灶及明显的高胆固醇血症，与人类AS病变类似，具有自然发生、渐进发展、病理形态典型等特点，是目前研究AS斑块较理想的动物模型[25]。为此，本研究以ApoE-/-小鼠为研究对象，对温阳活血解毒方抗AS的可能作用机制进行进一步探究。

本研究血脂检测结果显示，与模型组比较，中药高剂量组ApoE-/-小鼠血清中LDL-C、TC和TG水平显著降低，HDL-C水平显著升高，提示温阳活血解毒方可通过调节血脂，降低AS斑块脂质核心大小。病理学结果显示，中药高剂量组小鼠主动脉粥样斑块明显趋于稳定，表明温阳活血解毒方具有稳定斑块的作用。关键分子检测结果显示，与模型组比较，中药高剂量组ApoE-/-小鼠主动脉中Caveolin-1蛋白的表达量明显增加，p-ERK1/2蛋白的表达量明显减少，提示温阳活血解毒方可上调主动脉Caveolin-1蛋白表达，下调ERK1/2的磷酸化水平，抑制ERK1/2信号通路的激活，故推测其可能是温阳活血解毒方防治AS不稳定斑块、抑制主动脉内炎症及血管平滑肌细胞凋亡的机制之一。此外，本研究结果表明，温阳活血解毒方对Caveolin-1/ERK通路mRNA表达无影响，考虑其原因可能是信号分子的产生不仅需要mRNA模板，亦受其他相关酶及蛋白因子的影响，而其中的具体机理还需进一步研究。

综上所述，温阳活血解毒方可调节血脂水平、稳定AS易损斑块，这种作用机制可能与其上调主动脉Caveolin-1蛋白表达，抑制ERK1/2信号通路的激活有关。此为防治AS提供了新思路、新靶点、新方向，但其具体的分子机制有待进一步深入研究完善。