千草方熏洗对膝骨关节炎大鼠软骨的保护作用及相关机制

李宏军， 施源， 何敏， 李坚， 王君君， 邓新超， 鲁密，张辉， 吴岩， 吴红丽， 梁平

（武汉市第八医院，湖北武汉430010）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis）属老年性退行性关节疾病，其病理特征除表现为关节软骨的损伤和损失外，还合并有关节下骨的重塑、骨赘形成、韧带松弛、关节周围肌肉减弱等病变，并在一些病例中存在滑膜炎症[1]。本课题组前期研究表明，千草方熏洗联合关节内注射透明质酸（hyaluronic acid）能够有效缓解膝骨关节炎，降低膝骨关节炎的炎症因子水平，延缓关节软骨的破坏[2-3]，但有关千草方熏洗治疗膝骨关节炎的具体机制尚不明确。因此，本研究构建了膝骨关节炎大鼠模型，观察千草方熏洗对大鼠膝骨关节炎的治疗作用及其机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物10周龄SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，体质量（300~350）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物质量合格证号：11401300043471。动物实验方案通过武汉市第八医院动物伦理委员会批准。大鼠饲养于SPF环境中，温度为22~26℃，相对湿度为50%~60%，12 h明暗光源，自由饮水和进食。

1.2 药物、试剂与仪器千草方组成：千年健30 g、鹿衔草30 g、透骨草20 g、伸筋草20 g、防风20 g、木防己20 g、丹参20 g、牛膝20 g。中药材由武汉市中医医院中药房提供。透明质酸钠购自山东正大福瑞达制药有限公司（国药准字H10960136）。米醋（江苏恒顺醋业股份有限公司）；白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）检测试剂盒，Masson染色试剂盒均购自Bio-Swamp（中国）；兔抗Ki67、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GS3Kβ）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、β-actin等抗体及小鼠抗糖原合成酶激酶3β（GSK3β）抗体均为英国Abcam公司产品。DHG-9023A恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司）；MD1000光学显微镜（徕卡显微系统有限公司）；Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能公司）；352型酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS公司）。

1.3 分组与造模适应性饲养1周后，按照随机数字表将32只SD大鼠随机分为正常组、模型组、千草方组和透明质酸钠组，每组8只。除正常组外，其他3组大鼠采用改良Hulth法[4]建立膝骨关节炎模型。造模方法：腹腔注射2 mL/kg戊巴比妥钠（30 g/L）麻醉大鼠，于无菌条件下切除大鼠右膝内侧半月板及内侧副韧带，术后向大鼠肌内注射20 U青霉素以预防感染，每天1次，连续3 d。正常组大鼠，不做额外处理。

1.4 给药千草方组于动物模型制备后，将千草方置于蒸发器内，加水至2~2.5 kg，加米醋50 mL，制成浓度为10%的药液，接通电源加热，产生蒸汽，温度为40~45℃。将患膝（熏洗部位以膝关节髌骨为中心，上下各约3 cm）置蒸汽上，每日1次，每次30 min，连续熏洗30次。透明质酸钠组于动物模型制备后的第1周开始关节内注射0.4 mL/kg透明质酸[2]，其后每周重复注射1次，共干预5次。模型组和正常组不给予任何治疗处理。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 酶联免疫吸附分析（ELISA）给药结束后，于腹主动脉穿刺取血，收集血清。取40 μL待测样品于酶标板孔中，分别加入IL-6、IL-10和TNF-α抗体10 μL，轻轻摇晃。每孔加入50 μL酶标试剂，室温下孵育30 min，洗涤液洗涤5次后，加入显色试剂混匀，避光显色10 min，加入50 μL终止液终止反应，应用酶标仪测定各孔450 nm波长处的吸光度值。根据标准曲线计算IL-6、IL-10和TNF-α的浓度。

1.5.2 苏木素-伊红（HE）染色法将膝关节标本置于100 g/L多聚甲醛中固定48 h后，放入20%EDTA液中并于4℃冰箱内脱钙4周，每3 d换脱钙液1次。然后，进行常规石蜡包埋和切片。切片脱蜡脱水后进行常规HE染色。苏木素染核15 min，流水冲洗，0.5%伊红染液3 min，流水冲洗。光学显微镜下观察软骨组织病理变化，使用Mankin’s法对关节软骨组织损伤进行评分[5-6]。

1.5.3 Masson染色法按照Masson染色试剂盒说明书进行染色。方法：将膝关节石蜡切片置于苏木素三氯化铁混合液（1∶1）中染色10 min，流水冲洗后，置于丽春红酸性复红液中浸染5~10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸水溶液分化5 min后，将切片放入苯胺蓝水溶液染5 min，2%冰醋酸水溶液浸洗。梯级浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜下观察。

1.5.4 免疫组织化学法取膝关节组织石蜡切片常规脱蜡脱水后，于65℃恒温箱中烤片1 h，用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液高压修复15 min，然后加入3%H2O2以消除内源性过氧化物酶，滴加一抗Ki67（1∶200）孵育过夜，滴加生物素标记的二抗，滴加二氨基联苯胺（DAB）溶液，苏木素复染3 min，1%盐酸酒精分化，并于显微镜下观察控制染色程度。常规脱水，透明，干燥后，于光学显微镜下观察。

1.5.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法采用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液提取膝骨关节软骨总蛋白，12 000×g于4℃离心15 min后，取上清液进行蛋白质浓度测定。然后用12%的分离胶、5%的浓缩胶进行蛋白质电泳，90 V转膜50 min，以50 g/L脱脂奶粉室温下封闭2 h，洗涤，加入p-Akt（1∶500稀释），4℃孵育过夜，洗涤，加入对应的二抗，室温孵育2 h后，将膜放置在暗室中，加入电化学发光（ECL）试剂显影，最后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测。Akt（1∶500）、p-mTOR（1∶1 000）、mTOR（1∶2 000）、p-GSK3β（1∶1 000）、GSK3β（1∶1 000）、CyclinD1（1∶10 000）、β-actin（1∶2 500）检测方法同上。

1.6 统计方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α的含量变化比较表1的结果显示：与正常组比较，模型组血清IL-6和TNF-α的含量显著增加，模型组IL-10的含量显著降低（P<0.05）。与模型组比较，千草方组和透明质酸组血清IL-6和TNF-α的含量显著降低（P<0.05），IL-10的含量显著增加（P<0.05）；但千草方组血清IL-6和TNF-α的含量高于透明质酸组（P<0.05），IL-10的含量明显低于透明质酸组（P<0.05）。

表1 各组血清IL-6、IL-10、TNF-α的含量变化比较Table 1 Comparison of the serum contents of IL-6，IL-10，TNF-α in various groups （±s）

表1 各组血清IL-6、IL-10、TNF-α的含量变化比较Table 1 Comparison of the serum contents of IL-6，IL-10，TNF-α in various groups （±s）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较；③P<0.05，与透明质酸组比较

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2.2 各组软骨组织形态学比较图1、2结果显示：正常组软骨表面光滑，软骨基质着色均匀，各层细胞排列整齐，结构清晰，潮线完整。模型组软骨表面粗糙破损，表层软骨糜烂、剥落，软骨基质着色不均匀，各层细胞排列紊乱，四层结构不清晰。与模型组比较，千草方组软骨表面更加光滑，虽然存在着软骨细胞的减少，结构较清晰，软骨基质着色较均匀。透明质酸组的软骨组织，也存在着软骨细胞的减少，与模型组比较，结构较为完整和清晰。

图1 各组软骨组织HE染色结果比较（×200）Figure 1 Comparison of HE staining results of cartilage tissue in various groups（×200）

图2 各组软骨组织Masson染色结果比较（×200）Figure 2 Comparison of Masson staining results of cartilage tissue in various groups（×200）

2.3 各组关节软骨组织损伤Mankin’s评分比较表2结果显示：与正常组比较，模型组Mankin’s评分值显著增加（P<0.05）。与模型组比较，千草方组和透明质酸组Mankin’s评分值显著降低（P<0.05）；但千草方组Mankin’s评分值明显高于透明质酸组（P<0.05）。

表2 各组关节软骨组织损伤Mankin’s评分比较Table 2 Comparison of Mankin’s scores for cartilage tissue injury in various groups （±s）

表2 各组关节软骨组织损伤Mankin’s评分比较Table 2 Comparison of Mankin’s scores for cartilage tissue injury in various groups （±s）

①P<0.05，与正常组比较；②P<0.05，与模型组比较；③P<0.05，与透明质酸组比较

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2.4 各组软骨组织Ki67表达比较图3结果显示，模型组软骨组织Ki67表达量低于正常组（P<0.05），千草方组和透明质酸组Ki67的表达量高于模型组（P<0.05），而2个治疗组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

图3 各组软骨组织Ki67表达比较Figure 3 Comparison of the expression of Ki67 in cartilage tissue of various groups

2.5 各组软骨组织Akt、mTOR、GSK3β磷酸化水平，CyclinD1蛋白相对表达量比较图4结果显示：与正常组比较，模型组软骨组织p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-GSK3β/GSK3β和CyclinD1的相对表达量显著减少（P<0.05）。与模型组比较，千草方组和透明质酸组软骨组织p-Akt/Akt、pmTOR/mTOR、p-GSK3β/GSK3β和CyclinD1的相对表达量均显著上升（P<0.05）；但千草方组软骨组织p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-GSK3β/GSK3β和CyclinD1的相对表达量显著低于透明质酸组（P<0.05）。

图4 各组软骨组织Akt、mTOR、GSK3β磷酸化水平，CyclinD1蛋白相对表达量比较Figure 4 Comparison of the phosphorylated expression levels of Akt，mTOR，GSK3β and relative expression level of CyclinD1 in cartilage tissue of various groups

3 讨论

膝骨关节炎属中医“痹证”范畴，主要因肾虚复感风、寒、湿邪导致瘀血阻滞关节筋络发为本病，其病机主要为肾虚血瘀、经络痹阻，为“本虚标实”之证。本课题组在治疗该病上采用具有散寒祛湿、发汗解表、疏通膜理、调和气血、舒经活络功效的千草方进行局部薰洗，可达到缓解膝部疼痛、修复膝关节活动功能，抑制退行性变进一步发展的目的。

膝骨关节炎的主要病理表现为关节软骨变性、脱落和炎性因子沉积[7]。IL-6、IL-10、TNF-α是骨关节炎病理过程中介导关节软骨破坏最重要的细胞因子[8]。本研究中HE染色、Markin’s评分和血清IL-6、IL-10和TNF-α的结果表明，成功构建了膝骨关节炎大鼠模型。经关节腔内注射透明质酸或千草方熏洗治疗后，软骨组织结构的破坏和炎性浸润等病理改变能够得到缓解。

Ki67是代表细胞增殖的关键基因之一，普遍认为Ki67的表达与细胞增殖呈正相关[9]。研究[10]发现，Ki67高表达可促进人骨关节炎软骨细胞的增殖。还有研究[11]表明，促进Ki67的表达可减少TNF-α、IL-7和IL-23的分泌，从而降低骨关节炎大鼠软组织损伤和炎症反应。CyclinD1是细胞周期调控的关键基因，CyclinD1的表达抑制会导致细胞周期的阻滞[12]。本研究结果显示，膝骨关节炎模型大鼠软骨中Ki67和CyclinD1表达量较正常组明显下降，经千草方熏洗后，软骨Ki67和CyclinD1表达量较模型组显著升高，提示千草方能够降低膝骨关节炎软骨细胞的周期阻滞，促进软骨组织细胞增殖。

Akt/mTOR信号通路是调控细胞生长和增殖的关键途径，对细胞的生长、增殖、存活、凋亡以及血管的生成和自噬等起到十分重要的作用[13]。研究[14-16]表明，Akt/mTOR信号通路与骨关节炎关系密切，激活Akt/mTOR通路可以减轻关节软骨的炎症反应。有研究[17]结果显示，膝骨关节炎大鼠软骨组织Akt和mTOR的表达量显著高于正常组。而下调GSK3β可保护软骨细胞[18]。另外，蛋白质磷酸化是生物界最普遍，也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰，是一种动态的生物调节过程。蛋白磷酸化与多种生物学过程如DNA损伤修复、转录调节、信号传导、细胞凋亡的调节等密切相关，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制[19-20]。本研究结果显示：模型组软骨组织Akt、mTOR、GSK3β的磷酸化水平较正常组显著降低（P<0.05）；经千草方熏洗治疗后，Akt、mTOR、GSK3β的磷酸化水平较模型组显著升高（P<0.05）。提示千草方熏洗可能是通过调节Akt、mTOR、GSK3β的磷酸化水平发挥抗膝骨关节炎的作用。

综上所述，千草方熏洗在一定程度上能够缓解膝骨关节炎，其分子机制可能与促进软骨组织Akt/mTOR信号通路蛋白的活化，进而促进软骨细胞增殖有关。